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生物膜是生命活动中许多重要反应发生的场所,细胞的能量转换、信息识别与传递、物质运送和分配等基本生命现象都与生物膜密切相关。而在生物膜中,发挥这些生物功能的主要物质是膜蛋白。电化学技术不仅可以研究电子传递过程的机理,而且还可以对生命物质的组成和形态进行研究。因此,采用电化学方法研究膜蛋白的结构和功能成为近期生物电化学的热点之一。本论文针对膜蛋白的电化学研究这一课题开展了如下几方面工作。
1、孔蛋白OmpF离子通道形成的电化学研究
OmpF是外膜蛋白质中的一种重要孔蛋白,在离子通道的形成中起着不可或缺的作用。在本研究中,用戊酸成功地从大肠杆菌外膜上提取出OmpF并用凝胶过滤层析方法进行了进一步的纯化。通过SDS-PAGE的分析,确认OmpF是一种单体为38.9 kDa的蛋白质。采用Fe(CN)63-/4-。作为电化学探针,我们发现OmpF可以与修饰在石墨电极表面的卵磷脂双层膜结合,形成离子通道。因此,我们可以很方便地根据氧化还原峰形的变化来判断离子通道的开启状态。随后,OmpF与卵磷脂在石墨电极上的比例、缓冲液的pH和离子强度等各种影响因素被详细研究。此研究为进一步研究其他自然界相类似的细胞膜中的生命活动过程提供了简单而快捷的方法。
2、细胞色素C氧化酶的电化学研究
细胞色素C氧化酶是真核生物线粒体内膜和需氧菌细胞膜电子传递链上的终端酶,承担着细胞色素C到氧分子的电子传递功能,是线粒体呼吸控制中的主要部位。目前发现细胞色素C氧化酶直接与ATP的合成相关,其功能异常往往导致许多能量代谢相关疾病的发生,研究细胞色素C氧化酶的结构、性质、功能之间关系,对揭示生命活动的本质及阐明许多疾病的分子机制具有重要意义。本论文中将采用电化学的方法,建立一个简单方便的研究体系。据文献报道,已经有几种方法将细胞色素C氧化酶固定于电极之上。其中包括短链烷醇自组装、蛋白自组装和脂质体包埋等方法。这些方法大都存在稳定性差,制备复杂等问题,造成了对细胞色素C氧化酶的电化学研究的障碍。本实验采用PEI为膜,与细胞色素C氧化酶共修饰石墨电极,该方法操作简单,无需过多的准备实验,获得了稳定良好的电化学响应,细胞色素C氧化酶在阴极峰电位和阳极峰电位分别位于0.195V和0.238V。这为进一步研究细胞色素C氧化酶的电化学行为奠定了基础。
3、环氧化酶的电化学研究
环氧化酶是前列腺素合成过程中的主要限速酶,可将花生四烯酸代谢成各种前列腺素产物。环氧化酶有两种异构酶,即环氧COX-1和COX-2。COX-2除了在炎症等过程中发挥重要作用外,还与肿瘤的发生、发展和转移密切相关。本文根据多种膜材料的各类特殊性质,选取了部分膜材料对环氧化酶-2的直接电化学进行了研究,其中包括聚合物材料聚乙烯亚胺(PEI)、表面活性剂Triton X-100、金纳米颗粒、卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)及巯基己醇。实验结果表明巯基己醇能够将环氧化酶-2有序的修饰到电极上,并且能够获得较好、较稳定的电化学响应,其阳极峰电位和阴极峰电位分别为-0.235V和-0.269V。为进一步研究环氧化酶-2及对其抑制剂的研究奠定了基础。