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研究目的：疟疾尤其是恶性疟目前仍然是世界上严重危害人类健康的主要传染病之一，研制有效的抗疟疫苗具有重要的理论意义和实际应用价值。由于疟原虫复杂的生活史、繁多的抗原成分及强大的免疫逃避能力，迄今在研究有效实用的疟疾疫苗方面还没有取得令人满意的成果。DNA疫苗技术的出现为疫苗的研制开辟了新的途径。与传统的蛋白多肽类疫苗相比，DNA疫苗具有诸多优点：它可在体内持续表达与天然抗原构象相似的抗原蛋白；不但可诱导机体的体液免疫，产生抗原特异性抗体，也可诱导机体的细胞免疫，产生细胞毒T细胞，而细胞免疫对于抵御像疟原虫这样的胞内寄生虫感染十分重要。 本实验室利用基因工程重组技术，合成了一个编码恶性疟原虫不同发育阶段抗原表位的保护性抗原复合基因HGFSP，此基因表达的重组蛋白疫苗及含HGFSP基因的重组痘苗活疫苗可诱导HGFSP特异性抗体生成，免疫血清可抑制体外培养的红内期恶性疟原虫的生长。本研究利用HGFSP与真核表达载体pcDNA3重组，构建重组真核表达质粒pc-HGFSP；脂质体介导转染肝癌HepG2细胞，观察HGFSP基因体外表达产物的抗原性；pc-HGFSP质粒DNA直接免疫小鼠，观察其在小鼠肌肉组织的表达及所诱导的体液和细胞免疫应答；观察pc-HGFSP免疫血清对体外生长红内期恶性疟原虫的抑制作用。通过探索疟原虫DNA免疫新途径，为结合应用HGFSP的重组蛋臼疫茵、DNA疫茵和重组痘苗病毒疫苗进行抗攻击试验奠定基础。 研究方法：一．重组真核表达质粒 P C十GFSP的构建及鉴定 1．亚克隆法构建重组真核表达质粒 p C爿GFSP；并用酶切鉴定。L脂质体介导法转染肝癌 HCpGZ纫1胞；G4选样堵养阳性细胞克隆后用问接免疫荧光试验门)观察 HGFSP抗原的表达；SDS。PAGE及 Western blot鉴定表达产物的抗原性。二．pc十GFSP质粒DNA免疫小鼠诱导的免疫应答1．碱裂解法大量制备pCKGFSP重组质粒及pCDNA3载体质粒。2．C57BL历小鼠随机分为：①NS对照；②pCDNA3 ＆体质粒对照；③pcKGFSP重组质粒组。盐酸hi比卡因匕 0 u g／ml于左后肢股四头肌注射预处理 24h后，于同一部位注射 ling／nl DNA溶液 0、lml，对照组注射等体积 NS或载体质粒，间隔 3周（dZI，d42）各同量加强免疫一次，于末次加强免疫后 2周（d56）和 4周（d70）取小鼠血清及脾细胞观察多项免疫学指标。3．ELIS＾法测定血清抗 IIGFSP－IgG含量：每组 6 ．q眼眶或割尾取血，1：100稀释后加入经 HGFSP抗原包被的 96孔板进行测定。4．淋巴细胞增殖活性测定：d56、d70取＊5 XIO忏L脾细胞悬液于 96孔板，每个样本分4组：①培养液空白对照；②pc－HGFSP实验组；＠ConA阳性对照；④转铁蛋白阴性对照，用MTT ＆测定并计算刺激指数SI。5．NK细胞活性测定：实验设靶纲胞自发释放孔、靶细胞最大释放孔、一脾细胞自发释放孔及实验孔（效应细胞＋靶细胞）。脾效应细胞（E）：YACd （T）。25：l及50：l，以 YAC－l为靶细胞用 LDH＆测定并计算NK细胞活性。6．CTL活性测定：于 d56取脚细胞悬液于 24孔板，加 Con A、rhIL．2和 HGFSP蛋白抗原培养 5天诱生CTLs，用 HGFSP蛋白抗原处理的 PSIS靶细胞按 NK活性测定方法测定并计算 CTL活性。7．CD4”、CDS”T细胞亚群测定：d56、d70取脾细胞按试剂盒的方法用抗CD4及抗CDS单抗进行，当日用流式细胞仪测定。8．血清一氧化氮（NO）含 2 量测定：d56，d70 t小鼠血清按NO试剂盒的方法进行。9．注射部位肌 肉组织免疫酶检查：取小鼠注射部位肌肉组织，固定、包埋。切片后进 行。10．脾脏指数测定：处死动物时称取小鼠脾脏重量，计算其占体重 的百分比。11．体外抑制试验；蜡烛缸法培养恶性疟原虫，5％山梨醇同 步化处理，加不同浓度pC－HGFSP免疫组小鼠血清，以同浓度pCDNA3 载体质粒兔疫组血请为阴性对照，于第24h及72h分取血样涂片染色镜 检，计算原虫抑制率。 结果；一，重组真核表达质粒P。－HGFSP的构建及鉴定1．酶切 电泳结果显示，pc－HGFSP可用 Hindlll和 BamHI yRta切切出约 600hp长 的 HGFSP完整基因片段，用 PSt单酶切，可切出约 350hp长的部分基 因片段，说明pc－HGFSP构建正确。2．IFA结果显示，pC－HGFSP／HepGZ 细胞产生较强的免疫荧光反应，而未经转染的HepGZ细胞无荧光反应。 3．SDS－PAGE及 WestsrS blot结果显示，PC－HGFSP／fICpGZ细胞裂解液 中出现一条分子量约23kDa的蛋臼条带，司”特异性为HGFSP蛋白抗原免 疫血清识别。二．P。－HGFSP质粒DNA兔疫小鼠诱导的免疫应答：1．免 疫后三次（d56、d70、d84）ELISA法测定，pC－HGFSP u疫小鼠血清 HGFSP抗原