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宫颈癌是严重威胁现代女性健康的肿瘤之一,宫颈癌在女性恶性肿瘤中位列第二,仅次于乳腺癌。然而宫颈癌的病因复杂,发病机制仍未完全阐明。人乳头状瘤病毒(Human papillomaviruses, HPV)被证实是宫颈癌的最重要危险因子,99.7%的宫颈癌都可检测到高危HPV DNA。宫颈癌筛查目前被认为是控制宫颈癌发病的最有效手段。如果宫颈癌能及早被发现,它属于极易治愈的癌症之一。因为经济发展状况和收入水平的原因,不同国家和地区宫颈癌的筛查手段有所不同。在西方发达国家,多采用细胞学检查,尤其是液基细胞学检查和HPV病毒DNA检测等方法,该方法灵敏度和准确度较好,但检测成本高;而在发展中国家和欠发达地区,则多采用宫颈涂片结合巴氏染色或乙酸染色法(VIA)来进行宫颈癌初步筛查,该方法检测成本相对较低,但特异性不好,假阴性率较高。最近有人报道,异常的宫颈鳞状上皮细胞溶酶体内酸性磷酸酶(Cervical acid phosphatase,CAP)活性增高,但CAP在宫颈鳞癌中的表达情况目前报道很少。我们通过观察CAP在宫颈鳞状上皮细胞内的变化,了解CAP的异常表达或激活在宫颈鳞癌诊断中的意义,研发一种新型检测试剂盒FSC-811(Fast screening kit for abnormal cervical cells)并对其诊断的有效性和敏感性进行临床试验。目的:本研究的目的是检测宫颈酸性磷酸酶的分布,制备宫颈异常细胞染色试剂盒并检测其稳定性,最后通过临床试验对试剂盒的有效性和敏感性进行评估。方法:取正常宫颈鳞状上皮细胞、Hela细胞、宫颈癌组织冰冻切片进行CAP染色,观察CAP的表达。制备试剂盒,筛选固定液。将试剂盒分别存放在不同温度下,以观察试剂盒的有效期。将染色工作液存放在4℃,观察试剂工作液的有效期。临床收取确诊宫颈癌患者的宫颈刮片标本,固定前在室温空气中放置不同天数后进行CAP染色,观察标本固定前在室温空气中存放的时间对CAP染色效果的影响。临床取宫颈癌阳性样本固定后在1×PBS中保存,每周取片检测,观察标本固定后在1×PBS中保存时间。将染色后的阳性标本用30%甘油封片,观察标本染色后甘油封片的着色稳定性。选择30例确诊为宫颈鳞癌的住院病人,手术前采集宫颈涂片,分别进行传统的巴氏染色和CAP检测。采用随机、双盲、对照试验对FSC-811试剂盒的有效性和敏感性进行评估。结果:1.正常宫颈组织细胞、宫颈癌及Hela细胞CAP的表达宫颈正常鳞状上皮细胞中FSC-811染色阴性;而Hela细胞中FSC-811染色阳性,胞浆呈鲜艳的红色。对宫颈组织染色发现,宫颈鳞状上皮表层细胞未检测到CAP表达,而宫颈腺上皮、子宫内膜上皮及癌细胞的胞浆中均检测到CAP的表达。宫颈脱落细胞涂片中单核-巨噬细胞FSC-811染色阳性。2.固定液的筛选及优化分别用福尔马林(甲醛:双蒸水=1:9)、混合固定液(65ml丙酮,37%甲醛8ml, 25ml枸橼酸盐溶液:枸橼酸18mmol/l,柠檬酸钠9mmol/l,NaCl12mmol/l)、4%的多聚甲醛、99.5%丙酮、99.5%甲醇、99.7%乙醇来固定Hela细胞,发现福尔马林固定效果较好,配制方便;4%的多聚甲醛、混合固定液固定效果较好,但配制较复杂;其他试剂固定后染色效果不好。3. CAP染色试剂配方的优化将CAP试剂的不同成分配成5种组分和7种组分,然后进行稳定性试验,结果发现7种组分的稳定性明显优于5种组分的配方,故选择7种组分的配方作为FSC-811的试剂盒组分。4. FSC-811的稳定性研究七种组分的FSC-811均可在25℃放置5天后转存4℃保存5个月;在37℃放置3天后转存4℃能保存1个月;45℃放置3天后转存4℃能保存1个月。温度对试剂的稳定性有影响,适当温度有利于试剂的保存。5.染色工作液存放在4℃的稳定性工作液在4℃下存放5天后着色效果开始下降。该染色工作液宜现配现用。6.宫颈涂片固定前在空气中存放时间观察宫颈癌阳性样本固定前在室温空气中放置1天,2天,4天后进行CAP染色,结果发现标本固定前在室温空气中放置4天后,染色效果有所下降。7.宫颈涂片固定后在1×PBS中保存时间观察取宫颈癌阳性样本固定后在1×PBS中保存,发现标本固定后在1×PBS中可以保存至22天,在此之前染色效果不受影响。8. 30%甘油封片的效果观察将染色后的阳性标本用30%甘油封片,每月观察一次,发现标本染色2个月后有褪色迹象,6个月后核褪色,细胞浆褪色明显。9. FSC-811对宫颈鳞癌染色效果观察选择30例确诊为宫颈鳞癌的住院病人,手术前采集宫颈涂片,分别进行传统的巴氏染色和CAP检测。CAP的检测采用FSC-811染色试剂盒,细胞胞浆中出现红色物质为CAP阳性。巴氏染色结果的判定采用TBS分级系统。结果显示宫颈鳞状细胞癌FSC-811染色阳性率为100%。10. FSC-811的临床试验采用FSC-811和巴氏染液分别对208例妇科门诊病人的宫颈脱落细胞进行染色。细胞胞浆中出现红色物质为CAP阳性。巴氏染色结果的判定采用TBS分级系统。结果显示传统巴氏染色对不典型鳞状上皮以上病变的检出率为1.44%,而FSC-811的检出率为11.50%,两者差异有显著性(P<0.01)。FSC-811对宫颈癌的检出敏感性为100%。结论:FSC-811筛查宫颈异常细胞的检查率明显高于传统巴氏染色。