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肥胖已经成为一个全球面临的严重公共健康问题。随着经济的发展和生活方式的改变,中国的肥胖人口也急剧增长,且呈起病低龄化的发展趋势。肥胖导致的代谢综合症,更是严重威胁人类健康。脂肪源性间充质干细胞(Human mesenchymal stem cells-adipose, HMSC-Ad)、脂肪源性多能干细胞(human multipotent adipose-derived stem cells, hMADSCs)、前体脂肪细胞(Human pre-adipocyte, Pre-Ad)的增殖及向成熟脂肪细胞分化的机制,一直是肥胖研究的重要方向。尽管随PPARγ、C/EBPα等一系列关键基因的发现,人们对脂肪细胞增殖及成脂分化的机制有了较深理解,然而针对这些靶标所开展的药物研发,并未在临床上获得良好的防治效果。因此肥胖防治仍不容乐观,积极寻找肥胖防治的新靶标并深入研究其相关机制仍是研究者努力的方向之一。miR-1908,是本课题研究小组通过高通量miRNA芯片筛选的、在人脂肪源性间充质干细胞和前体脂肪细胞中表达较低、在成熟脂肪细胞中表达显著上调的miRNA。结合Dicer (miRNA成熟的关键酶)脂肪特异性敲除可导致小鼠脂肪发育异常的报道,提示miRNA在脂肪细胞分化中的重要作用。因此,本研究首先探讨miR-1908与肥胖的相关性,并通过生物信息学分析miR-1908作用的靶基因集合的功能集合和富集的信号通路,为深入开展miR-1908在肥胖发生中的功能研究提供实验及理论基础;进一步以hMADSCs为研究对象,探讨miR-1908在hMADSCs增殖、成脂分化中的作用,并初步探索了miR-1908发挥功能的可能机制,有望为肥胖及其并发症防治提供新线索及潜在的干预靶标。第一部分miR-1908与肥胖相关性的探讨目的：通过观察miR-1908在脂肪细胞、肥胖/超重者脂肪组织中的表达及脂源性细胞因子对脂肪细胞中miR-1908表达的调控,对miR-1908进行生物信息学分析,探讨miR-1908与肥胖的相关性,为阐明miR-1908在肥胖中的作用提供理论和实验基础。方法：人脂肪组织来源的HMSC-Ad、Pre-Ad,以胰岛素、地塞米松、罗格列酮、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(3-Isobutyl-1-methylxanthine, MIX)方案诱导细胞分化为成熟脂肪细胞；对成熟脂肪细胞,给予脂源性细胞因子如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白介素-6(Interleukin 6, IL-6)、瘦素(leptin)、抵抗素(resistin))及游离脂肪酸(free fatty acid, FFAs),进行干预；取肥胖/超重人群(BMI>24)皮下脂肪组织9例,以BMI(18.5-23.9)正常人群皮下脂肪组织(16例)为对照；采用Realtime PCR技术检测miR-1908在脂肪细胞、肥胖/超重者脂肪组织中的表达水平。采用miRBase检索miR-1908的序列特征,分析其物种保守性；采用TargetScan、Pictar和miRanda数据库检索miR-1908的靶基因,取三者交集得到靶基因集合,对靶基因集合进行GO分析(Gene Ontology Analysis, GO Analysis)和pathway分析(Pathway Analysis)。结果：1)miR-1908在HMSC-Ad、Pre-Ad诱导分化成熟的脂肪细胞中呈高表达模式；2)miR-1908在Pre-Ad诱导分化成熟脂肪细胞中的表达水平,受脂源性细胞因子及FFAs的调控；3)与BMI正常人群相比,miR-1908高表达于肥胖/超重者腹部皮下脂肪组织；4)miR-1908具有物种保守性,对miR-1908的靶基因进行GO和pathway分析,结果发现靶基因功能主要富集于肥胖、胰岛素抵抗及脂肪细胞增殖、分化密切相关的信号通路,如MAPK信号通路、胰岛素信号通路、细胞周期等。结论：miR-1908在分化成熟的脂肪细胞中高表达,并受脂源性细胞因子及FFAs的调控,miR-1908靶基因功能富集于肥胖及脂肪细胞增殖、分化相关的信号通路,提示miR-1908的功能可能与肥胖相关。第二部分miR-1908过表达对人脂肪源性多能干细胞的功能影响目的：观察miR-1908过表达对hMADSCs增殖、凋亡、细胞周期、成脂分化的影响。方法：体外培养稳定感染miR-1908慢病毒的hMADSCs,以转染空载病毒的hMADSCs为对照,胰岛素、地塞米松、罗格列酮、MIX方案诱导细胞分化成熟。CCK-8 (Cell Counting Kit-8)法检测细胞的增殖情况；流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期；油红O观察]hMADSCs成脂分化过程中脂滴形成情况；酶比色法检测成熟脂肪细胞中的甘油三酯含量；采用Realtime PCR、Western Blot技术,检测脂肪细胞分化关键基因(PPARγ、C/EBP-α)及蛋白的表达水平。结果：1)过表达miR-1908具有促进hMADSCs细胞增殖的作用,对hMADSCs细胞凋亡无明显影响,在hMADSCs细胞周期中可以促进G1期向S期的进程,使更多的细胞进入S期；2)过表达miR-1908尽管下调了第15天脂肪细胞分化关键基因PPARγ、C/EBP-α mRNA的表达,但对hMADSCs成熟脂肪细胞中脂滴形成、甘油三酯含量、PPARγ与C/EBP-α蛋白水平无明显影响。结论：1)过表达miR-1908促进]hMADSCs的细胞增殖；2)过表达miR-1908对hMADSCs成脂分化无显著影响。第三部分miR-1908调控人脂肪源性多能干细胞功能的可能机制目的：初步探讨miR-1908过表达对hMADSCs功能影响的可能机制。方法：体外培养稳定感染miR-1908慢病毒的hMADSCs,以转染空载病毒的hMADSCs为对照；应用基因表达谱芯片技术,检测miR-1908过表达hMADSCs中的差异表达基因；采用Realtime PCR验证基因表达谱芯片的结果。结果：1)过表达miR-1908的hMADSCs中共有123个差异表达的基因,其中表达上调的有69个,表达下调的有54个；2)差异表达基因的分子功能涉及15个不同的组,Pathway分析则发现miR-1908过表达影响了胰岛素信号通路与nTOR信号通路；3)验证基因表达谱芯片结果发现,CORO6、ST14、KCNC3等差异基因表达水平显著下调,与基因表达谱芯片结果基本一致。结论：1)以基因表达谱芯片技术检测差异表达基因,与预测的miR-1908的靶基因进行联合分析,经验证后发现基因表达谱芯片的结果可信度较高；2)miR-1908过表达影响hMADSCs功能的机制复杂,可能与胰岛素信号通路、mTOR信号通路等有关。