论文部分内容阅读
目的:外泌体可参与肿瘤细胞侵袭、转移和血管生成等生物学过程,而侵袭转移是大肠癌患者死亡的主要原因。研究表明肿瘤细胞分泌的外泌体能够携带miRNA到受体细胞中,调控受体细胞增殖、侵袭、转移等生物学功能。据报道miR-210-3p在肺癌、肾癌中表达上调,可调控乳腺癌的细胞增殖、迁移和侵袭,但大肠癌细胞来源的外泌体是否表达miR-210-3p以及其在大肠癌细胞侵袭转移中的作用未见报道。因此,本研究将探讨高转移性大肠癌细胞来源的外泌体miR-210-3p在细胞迁移和侵袭过程中的作用机制。研究方法:1、miR-210-3p对大肠癌细胞迁移、侵袭的影响:(1)采用dbDEMC和OncomiR数据库分析miR-210-3p在大肠癌组织中的表达及其对大肠癌患者预后的影响;(2)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同转移潜能的大肠癌细胞中miR-210-3p的表达;(3)qRT-PCR检测转染miR-210-3p mimics、inhibitor后,SW480细胞内miR-210-3p的表达水平变化;Transwell迁移和侵袭实验检测转染miR-210-3p mimics、inhibitor后,SW480细胞迁移和侵袭能力的变化。2、外泌体的提取及表征:(1)采用超速离心方法提取高转移性大肠癌SW620细胞分泌的外泌体;(2)通过透射电镜技术对提取的外泌体进行形态学表征;(3)采用Western blot检测外泌体中标志性蛋白分子的表达情况,进行分子表征。3、外泌体来源的miR-210-3p对SW480细胞的作用:(1)qRT-PCR检测不同转移潜能的大肠癌细胞来源的外泌体中miR-210-3p的表达情况;(2)qRT-PCR检测与SW620细胞来源的外泌体孵育后,SW480细胞内miR-210-3p的表达情况;(3)Transwell迁移和侵袭实验检测外泌体来源的miR-210-3p对SW480细胞迁移、侵袭能力的影响。4,miR-210-3p靶基因的预测与生物信息学分析:(1)采用miRDB、TargetScan7.2、starBase和mi RPathDB数据库预测miR-210-3p靶基因;(2)利用DAVID数据库进行GO生物学注释及KEGG信号通路富集分析;(3)利用String数据库分析筛选关键靶基因;(4)通过GEPIA进行关键性靶基因的表达验证。结果:1、miR-210-3p促进大肠癌细胞迁移、侵袭:(1)dbDEMC数据库分析显示,大肠癌组织中miR-210-3p的表达量明显高于癌旁组织,转移大肠癌组织中miR-210-3p的表达量显著高于原发癌组织;OncomiR数据库分析显示,miR-210-3p高表达的患者生存时间显著短于miR-210-3p低表达的患者;(2)qRT-PCR结果显示,高转移性大肠癌细胞系Lo Vo、HCT-116中miR-210-3p表达显著高于低转移性细胞系SW480、CL187、HCT-8;(3)qRT-PCR结果显示转染miR-210-3p mimics后,SW480细胞内miR-210-3p的表达水平升高;转染miR-210-3p inhibitor后,SW480细胞内mi R-210-3p的表达水平降低。Transwell迁移和侵袭实验表明上调miR-210-3p明显增强大肠癌细胞SW480的迁移、侵袭能力;下调miR-210-3p的表达后SW480细胞迁移、侵袭能力则显著减弱,提示miR-210-3p可促进大肠癌SW480细胞的迁移和侵袭能力。2、外泌体的提取和表征:(1)透射电镜结果显示,外泌体呈典型的杯状结构,大小约为60nm;(2)Western blot结果显示,外泌体高表达标志性分子CD63、CD9、CD81。结果提示成功提取到肿瘤细胞分泌的外泌体。3、外泌体来源的miR-210-3p促进SW480细胞迁移和侵袭:(1)qRT-PCR分析不同转移潜能的大肠癌细胞系内miR-210-3p的表达差异,结果显示:高转移性大肠癌SW620细胞分泌的外泌体中miR-210-3p的相对表达水平最高,且显著高于低转移性大肠癌SW480细胞外泌体中miR-210-3p的表达;(2)qRT-PCR实验结果显示:在与SW620细胞来源的外泌体孵育后,SW480细胞内miR-210-3p的表达显著上调;与转染inhibitor的SW620细胞来源的外泌体孵育后,SW480细胞内miR-210-3p的相对表达水平显著降低,表明高转移性大肠癌SW620细胞来源的外泌体miR-210-3p可被递送至受体细胞SW480细胞内;(3)Transwell迁移和侵袭实验结果显示,SW620细胞外泌体来源的外泌体miR-210-3p可促进SW480细胞迁移、侵袭。4,mi R-210-3p靶基因的预测与生物信息学分析:(1)miRDB、TargetScan7.2、starBase和miRPathDB数据库共预测到3035个靶基因;(2)GO生物学分析显示:在生物功能方面,靶基因功能主要富集在细胞迁移、细胞黏附、血管生成等;细胞组分方面,主要富集在细胞核、胞浆、吞噬小泡中;分子功能方面,主要富集在转录因子活性、铁锌离子转运等;KEGG信号通路富集分析显示:靶基因主要涉及癌症通路、HIF信号通路、Rap1信号通路等多个迁移相关信号转导通路;(3)String数据库分析显示有25个关键靶基因所编码的蛋白质起关键作用;(4)GEPIA结果显示RGMA在大肠癌组织中的表达显著低于正常组织,且其与大肠癌患者的预后相关。结论:1,miR-210-3p在高转移性大肠癌细胞中高表达,并且过表达miR-210-3p能够促进大肠癌细胞的迁移、侵袭过程。2,大肠癌细胞分泌的外泌体可通过水平递送的方式将miR-210-3p运输至受体细胞内,并促进其迁移和侵袭。