论文部分内容阅读
胃饥饿素(Ghrelin,GHRL),是1999年在大鼠胃肠道内发现的含28个氨基酸的多肽,广泛分布于动物体内。越来越多的的研究证明,GHRL及其受体(GHSR-1α)在下丘脑-垂体-性腺轴上具有类似神经内分泌调控的作用,推测GHRL参与了生殖,特别是卵泡发育的调控。脂多糖(Lipopolysacchrides,LPS)是革兰氏阴性菌细胞外壁的组成成分。奶牛瘤胃微生物在代谢过程中会产生游离的LPS,可经肠道吸收进入机体内环境,表明机体内可能长期存在低浓度的LPS,这种低浓度的LPS是否对卵泡发育产生影响,目前尚不清楚。本实验以体外培养的小鼠卵巢颗粒细胞(GC)为模型,从受体和信号通路角度研究GHRL与LPS对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡和生殖激素分泌的影响及作用机制,旨在探讨GHRL和LPS对卵泡发育的调节作用。研究内容和结果如下:1.GHRL对卵巢颗粒细胞的作用及其机制(1)GHRL受体GHSR-1α在GC细胞表达情况。目的:研究GC细胞上是否存在GHRL受体以及受体基因表达与GHRL浓度的关系。方法:本研究分别在GC细胞的培养液中添加浓度为0、10-6、10-7、10-8mol/L的GHRL,24h后裂解细胞收集蛋白,采用Western Blotting技术检测GHSR-1α的蛋白表达情况。结果:GC细胞能够表达GHSR-1α蛋白,但是实验组GHSR-1α的表达量低于对照组,提示GHRL可能引起GC细胞产生针对GHRL的反馈抑制现象。(2)GHRL对GC细胞周期和凋亡的影响目的:研究不同浓度的GHRL对GC细胞周期与凋亡的影响。方法:分别在GC细胞培养液中添加0、10-6、10-7、10-8mol/L的GHRL,24h后利用流式细胞仪(FCM)进行周期与凋亡的检测。结果:FCM结果表明不同浓度的GHRL对GC细胞的周期没有显著影响;随着GHRL浓度的增加,GC细胞的凋亡逐渐上升(p<0.01);(3)GHRL对生殖激素相关基因表达的影响目的:研究10-7mol/L的GHRL对GC细胞在生殖激素分泌相关的基因表达上的影响。方法:在GC细胞培养液中添加10-7mol/L的GHRL,24h后提取细胞总RNA,并利用Q-PCR技术研究生殖激素基因表达情况。结果:10-7mol/L的GHRL能够促进与生殖激素分泌相关的基因表达(p<0.05),包括:FSHr,INH-βa,AR,LHcgr,P450scc,StAR等。(4)ghrl对雌激素(e2)与孕酮(p)分泌的影响目的:研究不同浓度的ghrl对gc细胞雌激素(e2)与孕酮(p)分泌的影响。方法:分别在gc细胞培养液中添加0、10-6、10-7、10-8mol/l的ghrl,处理24h后,利用放射性免疫检验法(ria)检测gc细胞培养液中的雌二醇(e2)与孕酮(p)含量的变化。结果:10-6mol/l的ghrl能促进gc细胞分泌e2和p(p<0.01),并且e2和p呈现对ghrl的剂量依赖性。(5)探究ghrl对mapk信号通路和akt磷酸化的影响目的:探究ghrl对mapk信号通路和akt磷酸化的影响。方法:在gc细胞培养液中添加不同浓度的ghrl,24h后裂解细胞并收集蛋白,利用westernblotting技术探究包括erk,p-erk,akt,p-akt,p-p38,p-p65在内的通路蛋白表达情况。结果:erk和akt表达发生变化,表明ghrl对gc细胞的影响可能是通过mapk信号通路和akt磷酸化来实现的。2.lps对颗粒细胞的作用(1)lps对gc细胞增殖的影响目的:为了分析lps是否能够调控gc细胞增殖,凋亡和生殖激素分泌,并探索最佳作用浓度。方法:利用cck-8检测技术,用含lps(0、50、100、150和200μg/ml)的培养液刺激gc细胞。结果:低浓度的lps(50μg/ml和100μg/ml)对gc细胞增殖有极显著性的促进作用(p<0.01),而高浓度的lps(150μg/ml和200μg/ml)对gc细胞增殖有显著的抑制作用(p<0.01),其促进和抑制效果均有剂量依赖性。(2)lps对gc细胞周期和凋亡的影响目的:研究50μg/ml的lps对gc细胞周期与凋亡的影响。方法:分别在gc细胞培养液中添加含有50μg/ml的lps,处理24h后利用流式细胞仪(fcm)进行周期与凋亡的检测。结果:fcm结果表明50μg/ml的lps能够促进gc细胞由s期向g2期过渡,表明50μg/ml的lps对gc细胞有促增殖的作用(p<0.01);另外,50μg/ml的lps能够显著抑制gc细胞的凋亡(p<0.01)。(3)lps对生殖激素分泌相关基因表达的影响目的:研究50μg/ml的lps对gc细胞在生殖激素分泌相关的基因表达上的影响。方法:在gc细胞培养液中添加50μg/ml的lps,处理24h后提取细胞总rna,利用q-pcr技术检测与生殖激素分泌相关的基因表达情况。结果:50μg/ml的lps能够促进与生殖激素分泌相关的基因表达(p<0.05),包括:fshr,inh-βa,ar,lhcgr,p450scc,star等。(4)lps对雌激素(e2)与孕酮(p)分泌的影响目的:研究50μg/ml的lps对gc细胞雌激素(e2)与孕酮(p)分泌的影响。方法:别在gc细胞培养液中50μg/ml的lps,处理24h后,利用放射性免疫检验法(ria)检测GC细胞培养液中的雌二醇(E2)与孕酮(P)含量的变化。结果:50μg/ml的LPS能促进GC细胞分泌雌二醇和孕酮(p<0.01)。综上所述,本研究发现GHRL与LPS对小鼠卵巢颗粒细胞的增殖,凋亡和生殖激素分泌的具有显著的调控作用,且GHRL的作用途径与MAPK,p-ERK和p-Akt相关。