论文部分内容阅读
增生性瘢痕（hypertrophic scar,HS）是一种皮肤软组织损伤之后机体过度修复导致的皮肤纤维化疾病,手术后的发病率可达40%-70%,而烧伤后的发病率更高达91%。HS主要的临床表现为损伤局部组织凸于正常皮肤的异常增生,并伴有疼痛、瘙痒等机体感觉不适,同时给患者带来局部组织外观和功能上的改变,如局部关节部位的瘢痕性挛缩等,严重影响了患者的身心健康。其确切的发病原因和机制目前尚未完全明确,临床上也缺乏特异性的治疗措施,而单纯的手术切除会产生新的瘢痕。增生性瘢痕成纤维细胞（hypertrophic scar fibroblasts,HSFs）是HS发生和发展过程中的主要效应细胞,且HSFs增殖和凋亡之间的不平衡也是临床上HS过度增生和持续存在的重要原因,因而抑制HSFs增殖和（或）促进HSFs凋亡可以成为临床上治疗HS的一个重要突破口。内抑素（endostatin）是O’Reilly等人从小鼠血管内皮瘤细胞的培养上清液中分离纯化得到的一种蛋白质,共184个氨基酸残基。先前的研究发现内抑素可特异性抑制血管内皮细胞增殖,通过进一步的研究证实,内抑素可以直接抑制部分肿瘤细胞增殖、迁移并诱导凋亡从而发挥抗肿瘤效应。我们早期的研究证实重组人内抑素（recombinant human endostatin,rh Endostatin）可特异性抑制佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞增殖并诱导其凋亡;Ren等证明內抑素可以通过降低瘢痕组织中bcl-2的表达和抑制瘢痕内新生血管的形成来抑制瘢痕的增生。本课题组前期的研究发现rh Endostatin（6.25,12.5,25,50,100μg/ml）可以直接抑制HSFs增殖,本实验正是在本课题组前期研究的基础上进一步探讨rh Endostatin（100μg/ml）对兔耳HSFs凋亡的作用并探讨其中凋亡相应的分子机制,从而为HS的临床治疗以及寻找药物治疗新靶点提供实验基础和理论依据。目的:观察rh Endostatin对HSFs凋亡的影响,探讨其作用的部分细胞与分子机制。方法:（1）HS模型制备与鉴定:新西兰大耳兔8只,分为正常组（2只）和HS模型组（6只）,模型组大耳兔建立兔耳HS模型;术后第28天,瘢痕形成;随机取两只兔耳瘢痕组织和正常兔耳皮肤行组织学观察,鉴定HS。（2）HSFs分离培养和鉴定:采用组织块培养法培养细胞,取第3代（传2代）细胞行波形蛋白免疫细胞化学染色鉴定HSFs。后续实验采用第3代细胞。（3）HSFs凋亡情况检测:将模型组细胞分为未处理组、內抑素处理组（100μg/ml）和5-氟尿嘧啶处理组（500μg/ml）,流式细胞仪（FCM）对细胞凋亡情况进行检测。（4）HSFs凋亡相关基因与蛋白检测:实时荧光定量PCR法检测c-fos,c-jun,NF-κB,fas,caspase-3,bcl-2和p53 m RNA;Western Blot法检测相应蛋白表达。（5）HSFs胞质内的Ca2+检测:Fluo-4/AM作为Ca2+指示剂,其终浓度为100mg/ml rh Endostatin灌流HSFs,同时用激光共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscope,CLSM）动态观察和记录HSFs在有无Ca2+液时胞质中的Ca2+荧光强度（fluorescence intensity,FI）变化,检测rh Endostatin对HSFs胞质Ca2+浓度（cytosolic free calcium concentration）[Ca2+]i的影响。结果:（1）术后28天,HS即形成。HE染色结果显示瘢痕组织较周围正常皮肤明显增厚,同时瘢痕组织内的胶原纤维也明显变粗变大,呈现出旋涡或结节状,形成胶原结节;同时伴有大量的成纤维细胞增殖以及小血管增生。（2）波形蛋白免疫细胞化学染色对第3代（传2代）细胞进行鉴定的结果显示:细胞胞质内含有大量的棕黄色颗粒,呈现成纤维细胞特性。（3）FCM分析结果显示,rh Endostatin（100μg/ml）可促进HSFs早期及晚期凋亡,且以早期凋亡更为显著,分别为（10.78±0.06）%、（2.12±0.04）%,差异较未处理对照组HSFs均具有统计学意义（P<0.01）。（4）实时荧光定量PCR及Western Blot分析结果显示,与未处理对照组HSFs相比较,rh Endostatin（100μg/ml）能明显降低HSFs c-jun,c-fos,NF-κB,fas,p53,caspase-3和bcl-2 m RNA和蛋白的表达水平（P<0.01）。（5）CLSM检测结果显示,当细胞处于无Ca2+液（D-Hanks缓冲液）中时,rh Endostatin（100mg/ml）不能引起HSFs胞质内Ca2+FI的改变。当细胞外缓冲液为有Ca2+液（Hanks缓冲液）时,终浓度为100mg/ml rh Endostatin灌流HSFs可使胞质Ca2+FI急剧增加达峰值,随即荧光开始减弱,FI随时间而缓慢下降。结论:（1）rh Endostatin可促进HSFs凋亡。（2）rh Endostatin促进HSFs凋亡与其降低c-fos,c-jun,NF-κB和bcl-2基因的表达与活化有关,同时该凋亡过程不依赖于fas,p53表达增加,也不被caspase-3活性降低所抑制。（3）rh Endostatin可引起HSFs胞外Ca2+内流,细胞内钙超载可能作为HSFs凋亡的一个重要始动环节。