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背景:microRNAs(miRNAs)是一类长约21-24个核苷酸的内源性非编码单链小RNA,通过与靶基因信使RNA(mRNA)的3’非编码区(3’-UTR)结合,在转录后水平靶向抑制mRNA的翻译,调节基因的表达,参与细胞分化、增殖、凋亡、新陈代谢等生理过程。越来越多的研究认为miRNAs参与肿瘤的发生发展,起促癌或抑癌作用。食管鳞癌miRNAs表达谱及其发病机制的研究在国内外尚不多见,前期本课题组利用人miRNAs基因芯片技术对3对食管鳞癌组织及其配对正常食管组织进行分析,结果发现miR-183在食管鳞癌组织中的表达是正常食管组织的4.24倍。研究表明miR-183高表达于结肠癌、肝癌、滑膜肉瘤、横纹肌肉瘤等肿瘤,促进肿瘤的进展;亦有文献报道其低表达于视网膜母细胞瘤,发挥抑癌作用。近期有文献报道miR-183的表达水平与食管鳞癌病人的患病风险有关,但其在食管鳞癌中的表达及其具体作用机制尚未见相关报道。目的:实时逆转录定量PCR法检测食管鳞癌组织、食管上皮内瘤变组织、配对正常食管组织中miR-183的表达水平,探讨miR-183对食管鳞癌细胞株的生物学影响及其作用机制。方法:1.人miRNA基因芯片技术筛查3对食管鳞癌组织及其配对正常食管组织标本中差异表达的miRNAs,选取miR-183为研究对象。2.Taqman探针实时定量PCR法分析32对食管鳞癌组织及其配对正常食管组织、30对食管上皮内瘤变组织及其配对的正常食管组织中miR-183的表达;定量PCR、Westernblot、免疫组化检测食管鳞癌组织及配对正常食管组织中pdcd4 mRNA、pdcd4蛋白的表达。3.TargetScan、miRBase、Pictar等生物信息学软件预测miR-183可能作用的靶基因;将miR-183类似物(抑制剂)或阴性对照物转染入食管鳞癌(ESCC)细胞,定量PCR检测靶基因mRNA水平,Western blot检测靶基因蛋白水平;分别构建含靶基因3’-UTR野生型及突变型的报告基因载体,与miR-183类似物或阴性对照物、海肾质粒共转染入ESCC细胞,采用双荧光素酶报告基因实验验证结合位点。4.分别转染miR-183类似物、miR-183抑制剂、si-pdcd4及相应的阴性对照剂于ESCC细胞,CCK-8检测细胞增殖能力;单克隆形成实验检测单个肿瘤细胞集落生长能力;流式细胞术检测细胞凋亡率;Transwell检测细胞迁移、侵袭能力。5.0μM、10 μM、20μM、40μM 四种不同浓度的 PI3K/AKT 抑制剂 LY294002作用于ESCC细胞,实时定量PCR检测ESCC细胞中miR-183水平变化,Western blot 检测 pdcd4,AKT,p-AKT 蛋白变化。结果:1.芯片共筛选出51对上调miRNAs,17对下调miRNAs,miR-183在该芯片结果中上调4.24倍。扩大样本量对miR-183在32例食管鳞癌组织中的表达进行分析发现其表达水平是配对正常食管组织的3.98倍(P<0.0001),在食管上皮内瘤变组织中的表达水平是正常配对食管组织的2.93倍(P<0.005);而pdcd4 mRNA及其蛋白在食管鳞癌组织中的表达水平分别是正常食管组织的0.46倍、0.27倍(P<0.05),免疫组化结果显示pdcd4蛋白在食管鳞癌组织中的染色程度(0.178±0.021)低于食管正常组织(0.267±0.031)(P<0.05)。2.生物信息学软件预测pdcd4是miR-183的靶基因之一;转染miR-183类似物或抑制剂后,pdcd4 mRNA的表达量与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),而pdcd4蛋白表达水平却随着miR-183水平的升高而降低(P<0.005);双荧光素酶报告基因实验示miR-183与pdcd4 3’-UTR野生型质粒的荧光值降低(P<0.05),而突变型质粒的荧光值变化差异无统计学意义(P>0.05)。3.miR-183 mimics 作用的 Eca109 细胞,其 24h,48h,72h,96h 的 CCK-8 值分别为 0.389±0.006、0.854±0.289、1.431±0.036、1.631±0.036,单克隆细胞形成数为214±17,细胞凋亡率为4.93±0.76,细胞迁移数为449±42,细胞侵袭数为402± 11;而阴性对照剂作用的Eca109细胞,其CCK-8值分别为0.339±0.113、0.679±0.192、1.273±0.035、1.483±0.082,单克隆细胞形成数为 116±9,细胞凋亡率为8.6±0.72,细胞迁移数为201±12,细胞侵袭数为271±13(P<0.05);si-pdcd4作用的Eca109细胞,其CCK-8值、单克隆细胞形成数、细胞凋亡率、细胞迁移数、细胞侵袭数相对于miR-183 mimics组细胞变化,差异无统计学意义(P>0.05)。相应的,TE13细胞功能实验结果与Eca109细胞相似。4.10μM、20pM、40 μM三种不同浓度的LY294002作用于Eca109细胞后其miR-183的表达水平分别为空白对照组(0μM)的0.14倍、0.16倍、0.04倍,磷酸化AKT水平分别是空白对照组的0.67倍、0.81倍、0.85倍,pdcd4蛋白表达水平分别是空白对照组的1.24倍、1.13倍、1.21倍(P<0.05)。结论:1、miR-183高表达于食管鳞癌组织及食管上皮内瘤变组织;相反的,pdcd4低表达于食管鳞癌组织。2、Western blot和双荧光素酶报告基因实验证实miR-183靶向作用于pdcd4,验证了生物信息学软件的预测结果。3、miR-183可能通过负调控pdcd4的表达促进食管鳞癌的发生发展。4、抑制PI3K/AKT信号通路,ESCC细胞中miR-183的表达水平降低,p-AKT表达水平降低,pdcd4表达水平增高,提示AKT可能是miR-183的上游调控因子之一。