论文部分内容阅读
紫草作为一种重要的药用植物，其根部合成的红色萘醌类次生代谢产物--紫草宁及其衍生物(后面简称为：紫草宁)具有抗菌、消炎、活血、抗肿瘤等多种功效，同时还可作为一种优质的天然色素应用于食品、化妆品添加剂等。目前虽然已清楚了紫草宁生物合成的基本途径，并分离、克隆和鉴定了许多与紫草宁合成相关的代谢酶及基因，但其合成调控机制还很不清楚。研究表明，紫草宁的合成受到物理、化学、生物等多种因素的影响，如光照、金属离子、激素、真菌诱导子等。其中光照可强烈的抑制紫草宁的合成，而且这种抑制作用是可逆的，但目前对光信号在紫草宁合成代谢中的分子调控机制，特别是参与光信号调控途径的信号分子还知之甚少。
本课题组先前采用抑制消减杂交(SSH)和cDNA芯片技术分离黑暗和白光下紫草细胞差异表达基因的实验中发现了几个与乙烯合成及信号途径有关的基因，暗示乙烯作为一种激素信号分子，可能在光信号调控紫草宁合成中起到重要的作用，深入研究其分子机制将为高效调控紫草宁的合成奠定理论基础。
本文以硬紫草(Lithospermum erythrorhizon Sieb.et Zucc)高产细胞系Y8为材料，克隆了紫草EIN3基因(乙烯信号下游转录因子)和A350基因(由SSH和cDNA芯片技术发现的在黑暗和光照培养条件下差异表达的基因)的全长。克隆的紫草EIN3基因的cDNA全长共2294 bp，该基因编码了一个含635个氨基酸的蛋白，BLASTX和进化树分析显示，该基因是一个编码EIN3类转录因子的基因，将其命名为LeEIL-1，Genbank登录号为FJ890314。克隆得到的紫草A350基因的cDNA全长共1077 bp，该基因编码了一个含247个氨基酸的蛋白，BLASTX和进化树分析显示，A350基因与编码伸展蛋白的基因具有高度的同源性，是一个在紫草中发现的编码伸展蛋白类的基因，将其命名为LeEXT-1，Genbank登录号为FJ890315。
基因表达分析结果表明，在6d的培养周期内，相对于黑暗培养，白光显著上调了紫草LeEIL-1基因的表达；在白光预培养2d后转入黑暗培养，黑暗条件也抑制了LeEIL-1基因的表达；此外，Western Blot的结果显示从生长培养基B5转到紫草宁合成培养基M9，伴随着色素的产生，紫草LeEIL-1蛋白在细胞内积累。这些结果均表明光信号参与调控了紫草LeEIL-1基因的表达和细胞内LeEIL-1蛋白的水平。还检测了LeEIL-1基因和LeEXT-1基因在M9培养基黑暗培养条件下早期(1d内)表达模式。结果表明，在从生长培养基B5转到紫草宁合成培养基M9的前2 h内，这两个基因均被快速诱导表达，随后又逐渐下降到一个稳定的水平，这种表达模式与实验室前期研究中发现的紫草宁合成相关基因中的PAL，4CL，HMGR等的早期应答模式类似，但LeEIL-1基因和LeEXT-1基因是否参与紫草宁的合成调控还需进一步深入探讨。本研究克隆了紫草EIN3基因LeEIL-1和紫草伸展蛋白基因LeEXT-1的全长并进行了初步的表达分析，为进一步采用转基因、RNA干扰等分子生物学方法研究光信号调控紫草宁合成的确切机制奠定了基础。