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piggy Bac转座系统已成为在转基因昆虫中使用最广的转座子,已被证明能在20多种昆虫中转座。斜纹夜蛾属鳞翅目昆虫,是世界性分布害虫。本研究通过显微注射进行基因转移,利用鳞翅目来源的转座子piggyBac建立高效稳定的转基因斜纹夜蛾技术体系,为今后利用转基因技术控制斜纹夜蛾的危害、应用于斜纹夜蛾基因的功能以及探明其发育过程的基因调控机理等基础研究奠定基础。
1)本研究使用液压显微系统,通过制备特制注射针和选取合适的注射方式,突破斜纹夜蛾坚硬卵壳的阻碍,建立起一套适合斜纹夜蛾的基因转移方法。使用该方法,在熟练的基础上,每小时可注射200~300粒卵。
2)将注射后的卵置于饱和湿度的环境中一段时间后,注射孔的伤口能够逐渐愈合,保护卵不会因为注射而导致其水分的流失。饱和湿度处理后幼虫的孵化率和胚胎后期率分别达到40.9%和61.3%,其效果显著优于胶水封口处理和75%饱和湿度处理。
3)对发育时期相同的卵,分别在其前后极注射相同浓度和比例的piggyBac和helper。结果表明,与在卵前极注射相比,在卵后极部位注射后piggyBac的转座率更高。
4)对不同发育时期的卵注射显微缓冲液,发现幼虫孵化率在5 h前随时间延后而逐渐提高,5 h后孵化率趋于相同。
5)显微操作各环节中,注射过程中的机械伤害对胚胎造成较大伤害,显微缓冲液对胚胎的伤害小于TE缓冲液。随着注射质粒DNA浓度的增加,卵内荧光表达率逐渐升高,而孵化率逐渐降低;质粒浓度超过100 ng/μl的对幼虫孵化率的影响较大,质粒浓度在100 ng/μ1~170ng/μl,对幼虫孵化的影响趋于缓和。
6)将浓度为140~170 ng/μl、1:1混合的piggybac和helper的混合质粒注射进入早期胚胎发育的卵中。在蓝色荧光下观察和记录EGFP在胚胎、幼虫及蛾中的表达情况,并对表达绿色荧光的个体进行筛选。结果发现:在胚胎的各个时期、G0代及其后代的1~3龄幼虫和蛾的复眼中都观察到了EGFP表达的绿色荧光。筛选出的转基因虫在其第四代仍能观察到EGFP的表达。利用PCR技术对表达EGFP的个体进行鉴定,发现阳性个体能扩增出EGFP片段,而阴性对照则不能,并在GO转基因幼虫的表皮、中肠、脂肪体及蛹的中肠均检测到。EGFP的存在。这表明:EGFP已通过plggybac整合到斜纹夜蛾的基因组中并表达,且能够稳定遗传。
7)将注射piggyBac后5 h内卵的孵化率、荧光表达率及GO转基因虫获得率按注射时间排序,发现在3 h左右注射可获得最好的转基因效率,转基因虫的获得率与卵内荧光表达率紧密相关。
8)本实验共注射受精卵2576粒,注射piggyBac后,观察到有绿色荧光表达的卵数为507粒,占注射总卵数的19.7%;注射后孵化出幼虫424条,孵化率为16.4%。在孵化的424条幼虫中,经在荧光显微镜下筛选,共获得46条发绿色荧光的GO代转基因幼虫,占注射卵数的1.78%。国际上昆虫转基因效率普通较低,尽管本研究得到的斜纹夜蛾转基因效率已达到国际较高水平,但仍有许多地方需进一步完善。