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目的:恶性肿瘤近年来已经成为严重威胁我国人群健康的主要公共卫生问题之一,肿瘤的发病率和死亡率均呈上升趋势,防控形势十分严峻。当前人们迫切需求寻找发现抗肿瘤作用效果好且副作用小的天然抗肿瘤药物。有关茯苓多糖的研究也越来越多,很多研究表明茯苓多糖具有较好的抗肿瘤作用,但大多数茯苓多糖提取自茯苓菌核,培养周期长、产量低,提取多糖一般用超声或酶解的方式获取。利用液体发酵的方法从茯苓菌丝体发酵液中提取茯苓多糖周期短,成本低,水溶性多糖含量高,其用于抗肿瘤的研究较少,因此本实验主要利用液体发酵的方法提取茯苓发酵液多糖(PFBP)并在体内、外初步验证其抗肿瘤活性。方法:1.利用真菌液体培养基制备茯苓菌丝体发酵液,通过水提醇沉法提取发酵液多糖,利用苯酚-硫酸法检测多糖含量,计算多糖得率;2.通过PFBP体外直接作用H22小鼠肝癌细胞,以生理盐水为空白对照,顺铂为阳性对照,利用CCK-8法检测PFBP的细胞毒作用;3.通过建立H22荷瘤Balb/c小鼠模型,利用PFBP不同浓度(50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg)和生理盐水、顺铂分组处理小鼠,观察小鼠生存期、测量小鼠体重和腹围,取小鼠尾静脉血涂片瑞氏-吉姆萨染色观察实验小鼠外周血炎性细胞的变化,处死小鼠取肝脏,脾脏和胸腺并称重,取小鼠眼球血使用细胞因子试剂盒采用ELISA(酶联免疫吸附测定)法检测IL-2(白细胞介素-2)、IFN-γ(干扰素-γ)、TNF-α(肿瘤坏死因子-α)取小鼠腹水离心后制作石蜡切片并做HE(苏木精—伊红)染色,观察对腹水肿瘤细胞和免疫细胞的影响。结果:1.茯苓菌丝体经液体发酵得到茯苓菌丝体发酵液,水提醇沉法提取多糖,经苯酚-硫酸法检测其多糖浓度为10.1mg/mL,粗多糖得率为4.5%;2.PFBP体外直接作用于H22细胞,CCK-8检测细胞毒性显示PFBP体外能直接抑制H22细胞,并呈现时间-剂量依赖性,其最高浓度(2mg/mL)24小时和48小时抑制率分别为23.12%、35.7%,其抑制率低于顺铂24小时和48小时43.34%、75.96%的抑制率(p<0.001);3.治疗组以 PFBP 浓度 50mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg 为梯度给予荷瘤小鼠腹腔注射治疗,同时以生理盐水为空白对照,顺铂(20mg/kg)为阳性对照,结果显示在中、高浓度治疗组和顺铂组小鼠第8天的体重和腹围较空白对照组明显变小(p<0.01)且增长速度较慢,高浓度组增长最慢;4.PFBP高浓度组有2只小鼠生存到第30天,生理盐水组小鼠在第12天出现死亡,到第25天全部死亡,顺铂组小鼠在第20天死亡一只,最终有一只小鼠仍活到第30天。结果显示治疗组和顺铂组干预的荷瘤小鼠最后生存时间均比生理盐水空白对照组要长。5.治疗组和顺铂组的肝脏指数与对照组相比无明显差异(p>0.05),表明各组对肝脏影响差异不大。而治疗组和顺铂组的脾脏指数和治疗组的胸腺指数相比空白对照组相应指数变大并呈现出浓度依赖性,顺铂组的脾脏指数也高于空白对照组(p<0.001),而胸腺指数与对照组相比无差异(p>0.05);6.PFBP治疗组在中浓度和高浓度时相比空白对照组能显著提高血清IL-2含量(p<0.05),而低浓度组和顺铂组与对照组比较无差异,此结果在血清IFN-γ中显示相同的趋势,而治疗组的中浓度和高浓度以及顺铂组血清TNF-α含量相比空白对照组显著增加(p<0.05),低浓度组此三个细胞因子的含量与空白对照组相比均无差异(p>0.05);7.外周血涂片染色可见治疗组外周血大量炎症细胞浸润可见中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等,红细胞数目较多,排布紧密,而生理盐水组和顺铂组血涂片中红细胞排布比较稀疏,很少见到炎症细胞。腹水肿瘤细胞染色可见治疗组腹水中肿瘤细胞形态不规则,细胞体积较小,核边集,有的可以看到核碎裂,腹水中有大量炎性细胞和免疫细胞,如中性粒细胞,淋巴细胞和巨噬细胞等,而生理盐水组肿瘤细胞核深染,形态较规则,少见炎性细胞,顺铂组肿瘤细胞形态不规则,可见核不完整排列紊乱,炎症细胞较少。结论:1.水提醇沉法提取茯苓菌丝体发酵液中的多糖,经检测多糖浓度为10.1mg/mL,粗多糖得率为4.5%。2.利用CCK-8法检测PFBP体外作用H22细胞的细胞毒性作用,证实其体外具有一定的直接杀伤H22细胞的作用。3.经PFBP干预的H22荷瘤小鼠的生存期延长,小鼠腹水的症状减轻。4.PFBP能够使H22荷瘤小鼠脾脏和胸腺指数增加,对肝脏指数无影响。5.PFBP能够促进H22荷瘤小鼠血清IL-2、IFN-γ、TNF-α分泌增加,小鼠外周血和腹水中炎性细胞浸润,其主要依靠激发机体免疫功能来间接发挥抗肿瘤作用。