论文部分内容阅读
[背景]沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)泌尿生殖道感染是国内外最常见性传播疾病(sexually transmitted disease,STD)之一,每年全世界范围内约超过1亿人通过性传播而被感染。其大多数患者临床症状表现轻微而隐匿,但病程却迁延且难以治愈。近年来,抗生素耐药与衣原体持续感染的报道屡见不鲜,由于治疗效果欠佳、缺乏有效疫苗,因此衣原体感染的治疗是研究的热点与难点。本课题组前期已发现豚鼠包涵体性结膜炎衣原体噬菌体phiCPG1中最大的衣壳蛋白VP1对沙眼衣原体有着抑制和破坏的效果。[目的]通过各类生物信息学手段分析衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白VP1的性质与结构。结合上述数据对VP1蛋白进行截短表达并分别作用于沙眼衣原体,以期发现发挥VP1蛋白生物学功能的最佳区段并探究其功能结构域,并通过蛋白相互作用检测手段验证各截短VP1蛋白与沙眼衣原体的亲和力。原核表达沙眼衣原体多形外膜蛋白I(PmpI)基因,并进行免疫原性的鉴定,结合生物信息学分析探索其生物学特征。通过实验方法探究VP1蛋白在噬菌体对宿主衣原体侵袭过程中发挥作用的结构位点,为VP1蛋白结构分析及噬菌体对衣原体的作用机制提供重要的依据,为沙眼衣原体疾病的临床治疗开辟新的思路。[方法]用生物信息软件分析PmpI的基因序列并预测此蛋白的B细胞抗原表位及二、三级结构,原核表达N端及全长PmpI蛋白并免疫白兔制备兔抗N-PmpI多克隆抗体,通过共聚焦显微镜观测不同培养时相的PmpI蛋白在沙眼衣原体上的定位情况。用生物信息手段分析衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白VP1的基因序列并预测此蛋白的B细胞抗原表位及二、三级结构,通过密码子优化相关软件设计并优化VP1序列。结合计算机分析数据对VP1蛋白进行截短表达并免疫小鼠制备鼠抗FL-VP1多克隆抗体。采用CCK-8试剂盒检测VP1蛋白的细胞毒性作用并筛选出最适干预浓度;将VP1蛋白(终浓度50μg/mL)与沙眼衣原体E型标准株室温孵育1小时,并接种至单层致密的Hela细胞中,在Ct培养的过程中均加入VP1蛋白以模拟噬菌体感染其宿主衣原体的过程,通过碘染法来计数沙眼衣原体包涵体(inclusions)个数并计算生长抑制率,分析各截短VP1蛋白对沙眼衣原体生长发育过程的影响,探索发挥VP1蛋白生物学功能的最佳区段及其功能结构域。以Far-Western blot及GST pull-down技术检测不同截短长度VP1蛋白与沙眼衣原体多形外膜蛋白PmpI的结合力。通过最终实验结果探寻VP1蛋白的功能结构域。[结果]对蛋白质的二级结构及氨基酸亲水性、柔性区、表面可及性和抗原指数等预测结果进行综合分析,得出PmpI与VP1蛋白分别含有8个和12个优势B细胞表位,并得到了这两个蛋白的三级结构预测结果,获得了VP1基因的密码子优化序列。成功重组N-PmpI及FL-PmpI原核表达质粒,经诱导表达、亲和层析纯化后获得了活性蛋白并成功制备高效价多抗(1:51200)。成功构建FL-VP1及各截短VP1蛋白原核表达重组体,经表达、纯化后获得了活性蛋白并成功制备高效价多克隆抗体(1:102400)。经过全基因组合成获得了密码子优化后VP1序列(FL-oVP1),并成功获得其诱导表达及纯化产物。经细胞毒性检测,选取干预实验中蛋白的浓度为50μg/mL,在此浓度下,Hela细胞的活力≥90%。干预后发现体外重组表达的各截短VP1蛋白对Ct E型标准株的生长有着不同程度的抑制作用,抑制率从83.2%到6.8%,而对照组低内毒素BSA蛋白及PBS液并未表现出抑制作用。其中,表达18~476位氨基酸位点的VP1蛋白(VP1-C)抑制效果最好,为83.2%,抑制率高于全长表达的VP1蛋白(FL-VP1)。体外实验Far-Western blot及GST pull-down结果检验了各截短VP1蛋白与D型沙眼衣原体标准株PmpI蛋白的不同结合力。综合上述实验结果,推测VP1蛋白特异性的与Ct PmpI蛋白结合的区域可能主要在158~330氨基酸区域内,而330~502区域有较弱的辅助作用,推测VP1可能通过IN5环与Ins环共同作用来行使其生物学功能,不排除两环附近区域有未知结构辅助IN5及Ins环。而通过共聚焦荧光显微镜检测E型Ct PmpI蛋白在不同培养时间段的定位情况,推测作为自转运蛋白的PmpI蛋白很可能有从膜内到膜外的构象变化。[结论]不同截短设计表达的衣壳蛋白VP1对沙眼衣原体(Ct)的生长具有不同程度的抑制作用,并结合蛋白互作检测结果推测出了VP1蛋白可能的作用区域。为VP1蛋白在噬菌体对衣原体粘附作用机制的研究提供重要依据,开辟了沙眼衣原体疾病临床治疗的新思路。