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目的:通过建立人脐带间充质干细胞来源的外泌体(human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes,hucMSC-Ex)修复葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium salt,DSS)诱导的小鼠炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)模型,确定neddylation在hucMSC-Ex缓解小鼠IBD中的作用,深入研究hucMSC-Ex在调控neddylation修复小鼠IBD中的作用机制,进一步运用hucMSC-Ex治疗IBD。方法:1)HucMSC-Ex的分离鉴定:收集人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSC)培养上清液,通过相应试剂提取hucMSC-Ex并使用透射电镜、Nano Sight和western blot进行相关鉴定。2)选取6周、20g左右的雄性BABL/C小鼠,饮用含3%DSS的水以构建IBD模型。为明确hucMSC-Ex是否通过调控neddylation来缓解小鼠IBD,将小鼠随机分为3组:Neg、DSS和hucMSC-Ex组,每间隔3天尾静脉注射1 mg hucMSC-Ex。每天相同时间点记录小鼠体重,观察小鼠粪便性状以及是否出现血便,并依此分析疾病活动指数(disease activity index,DAI),于10天左右处死,取小鼠结直肠观察组织大体观,收集结直肠组织并制备组织切片、提取蛋白及总RNA。通过苏木素伊红(hematoxylin and eosin staining,H&E)染色分析结直肠结构紊乱情况、免疫组化(immunohistochemistry,IHC)检测组织中neddylation相关分子(NEDD8、cullin 1)的表达、实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time fluorescence quantification PCR,qRT-PCR)分析结直肠组织中炎性因子(IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α)的表达以及neddylation相关分子(NAe1、Uba3、E2M、UBC12F、DCNL1)的表达水平、免疫印迹(western blot)检测结直肠组织中neddylation相关分子(NEDD8、cullin 1、IκB、NF-κB、P-NF-κB)蛋白的表达水平及免疫共沉淀(coimmunoprecipitation,Co-IP)检测NEDD8与cullin 1的结合情况。3)体外培养人结直肠细胞(human colorectal mucosa cell,FHC),通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激模拟炎症环境,加入hucMSC-Ex缓解炎症。将细胞分为3组:Neg、LPS和hucMSC-Ex组,共培养12 h后收集细胞,提取细胞蛋白及总RNA。通过免疫荧光(immunofluorescence,IF)分析检测细胞中neddylation相关分子的表达、qRT-PCR分析细胞中neddylation相关分子的表达水平、western blot检测细胞中neddylation相关分子蛋白的表达水平以及Co-IP检测NEDD8与cullin 1的结合情况。4)为明确hucMSC-Ex中何种关键分子调节neddylation,将数据库预测的能够靶向NEDD8 m RNA 3’UTR的miRNA与hucMSC-Ex miRNA测序结果交叉比对并筛选出重合的miRNA。LPS诱导FHC细胞炎性环境,加入hucMSC-Ex,共培养12h后收集细胞,qRT-PCR检测FHC中筛选出的miRNA表达水平,重复试验4次,确定miR-326为关键分子。设计miR-326 mimics、mimics NC、inhibitor和inhibitor NC,与FHC进行转染从而过表达或敲减FHC中miR-326。转染后的细胞在LPS诱导下培养12 h后收集细胞,提取细胞蛋白及总RNA。通过IF分析检测细胞中neddylation相关分子的表达、qRT-PCR分析细胞中neddylation相关分子的表达水平、western blot检测细胞中neddylation相关分子蛋白的表达水平以及Co-IP检测NEDD8与cullin 1的结合情况。5)通过转染试剂盒将miR-326 mimics、mimics NC、inhibitor和inhibitor NC分别与hucMSC-Ex进行转染,并通过qRT-PCR分析hucMSC-Ex中miR-326表达水平从而验证转染效果。6)为验证hucMSC-Ex是通过miR-326抑制neddylation缓解小鼠IBD,将6周、20g左右的雄性BABL/C小鼠随机分为Neg、DSS、mimics、mimics NC、inhibitor和inhibitor NC组,饮用含3%DSS的水以构建IBD模型,每间隔3天尾静脉注射1 mg经miR-326 mimics、mimics NC、inhibitor和inhibitor NC转染处理的hucMSC-Ex。小鼠体重、DAI、结直肠组织大体观、组织结构、蛋白及总RNA检测同上。结果:1)成功分离出hucMSC-Ex,NanoSight纳米颗粒跟踪分析仪及透射电镜检测hucMSC-Ex直径约100 nm,western blot检测hucMSC-Ex表达CD9、CD63和CD81。2)Neg组小鼠随着时间的推进体重也随之上升,但是DSS组小鼠于第5天出现体重下降,并且也有血便出现,DAI急剧上升,hucMSC-Ex组小鼠在前6天体重基本没有变化,第6天后体重略有下降,但不明显。DSS组小鼠的结直肠明显缩短,hucMSC-Ex组小鼠结直肠长度有所恢复。促炎因子在DSS组小鼠结直肠组织中表达增加,在hucMSC-Ex组小鼠结直肠组织中表达显著降低,相反,抗炎因子在DSS组小鼠结直肠组织中表达降低,在hucMSC-Ex组小鼠结直肠组织中表达增加。3)相对于Neg组小鼠,DSS组小鼠结直肠组织中NEDD8、cullin 1、P-NF-κB表达水平增高,neddylation中相关的分子NAe1、Uba3、E2M、UBC12F、DCNL1表达也增高,同时促进NEDD8与cullin 1的结合,hucMSC-Ex组小鼠结直肠组织中neddylation相关分子表达水平均有所降低,NEDD8与cullin1的结合也受到了抑制。4)体外模拟细胞炎症环境,FHC细胞经LPS刺激后,相对于Neg组,LPS组细胞中neddylation相关分子表达水平增高,NEDD8与cullin 1的结合增强,经hucMSC-Ex处理后,细胞中neddylation相关分子表达水平均有所降低,NEDD8与cullin 1的结合受到抑制。5)FHC与miR-326 mimics、mimics NC、inhibitor和inhibitor NC转染后,经LPS刺激,mimics组相对于LPS组,细胞中neddylation相关分子表达水平均有所降低,NEDD8与cullin 1的结合受到抑制,但是inhibitor组相对于LPS组,细胞中neddylation相关分子表达水平均没有降低甚至增强,甚至促进NEDD8与cullin 1的结合。6)从小鼠体重、DAI、结直肠长度及组织紊乱程度方面,mimics组小鼠修复效果明显强于mimics NC组小鼠,但inhibitor组小鼠相对于DSS组有修复效果,但明显弱于mimics组,略弱于inhibitor NC组。mimics组相对于DSS组,小鼠结直肠中neddylation相关分子表达水平均有所降低,NEDD8与cullin1的结合受到抑制,而inhibitor组相对于inhibitor NC组,小鼠结直肠组织中neddylation相关分子表达水平均增强,NEDD8与cullin 1的结合也增强。结论:HucMSC-Ex可以通过miR-326抑制neddylation从而缓解DSS诱导的小鼠IBD。