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目的:乙型肝炎病毒是世界上肝脏感染性疾病发生的主要原因。目前对于乙型肝炎病毒生命周期，新的治疗药物，疾病发生学等的研究都难以深入进行，主要原因在于缺乏理想的细胞模型和动物模型。为试图解决此一问题，我们制备了人原代肝细胞并优化其培养条件，然后将此人原代肝细胞和新鲜的人正常肝组织分别移植到NOD/SCID鼠的肝脏和肾包膜下以建立起人-鼠嵌合体肝模型小鼠，此动物体内有正常的人肝细胞和肝组织。所以，用标准的人乙型肝炎病毒感染人原代肝细胞和此嵌合体动物可建立起乙型肝炎细胞模型和动物模型。做为肝向载体的候选者，围绕乙型肝炎病毒展开的研究已有十年之久。敲除了所有病毒开放读码框，并在S基因位置插入约800bp的报告基因。用此重组乙肝病毒载体感染人原代肝细胞和嵌合体动物，可确认其所携带的转基因表达能力和特异定向能力。我们构建的重组乙肝病毒载体为治疗性载体的研究奠定了基础；所建立的细胞模型和动物模型也为乙型肝炎病毒研究的各个领域提供了有用的工具。
方法:(1)从临床肝切除病人遗弃肝组织获取新鲜人正常肝组织，用改良的两步胶原酶法分离人原代肝细胞，按1.0×10<'5> viable cells/cm<'2>的密度将细胞接种到胶原铺被的培养瓶，先用含8﹪胎牛血清的培液，随后换以不含血清培液。
(2)将要进行肝细胞移植的NOD/SCID鼠用retrorsine预处理，第二次注射retrorsine后4周备用。行50﹪肝切除，将5.0×10<'5>活细胞通过门静脉注射方式进行移植；将1mm<'3>大小肝组织块移植到鼠。肾包膜下。通过ELISA法测动物血中hAAT水平以确定嵌合程度。
(3)为得到研究中所需标准乙肝病毒，构建DNA载体MC2009，其中两个标准野生型病毒基因组以头尾连接方式相连，转染到培养的人肝细胞中或通过注射进入鼠肝内后可产生有感染能力的野生型病毒。
(4)为构建以乙肝病毒为基础的载体，首先构建辅助质粒MC2018，其中含有一个标准野生型病毒基因组，但消除了包装信号ε和正向重复序列，其仅可以提供反式包装所需各种病毒蛋白，但不能组成一个完整乙肝病毒；同时构建传递质粒MC2013，其中以编码绿色荧光蛋白基因的PCR片段取代S基因，以泛素启动子取代病毒基因组序列中preS2/S启动子，在其余病毒开放读码框上引入终止子，UB.eGFP表达盒的表达由CMV启动子启动。辅助质粒MC2018和传递质粒MC2013通过水流动力学注射的方法送到鼠肝内包装成重组乙肝病毒载体。
(5)用标准野生型病毒感染人原代肝细胞和嵌合体动物，实时荧光定量PCR测定HBV DNA，ELISA法测定HBsAg。HE染色观察细胞形态，免疫荧光探查GFP/HBsAg表达，免疫组化确定HBsAg表达情况。
(6)用重组乙肝病毒载体感染人原代肝细胞和嵌合体动物，实时荧光定量PCR测定HBV DNA，ELISA法测定HBsAg，激光共聚焦和荧光探查GFP表达，流式细胞技术分析载体体外感染效率。
结果:每克肝组织平均人原代肝细胞产量为5×10<'5>细胞，细胞存活率为80﹪，12.4﹪为非实质细胞，其中包括2﹪枯否氏细胞，10.4﹪为肝窦上皮细胞，细胞在无血清培养条件下培养10周以上。载体MC2009产生的标准HBV水平为3×10<'7>copies/ml，鼠体内包装产生的重组乙肝病毒载体水平为5×10<'6> copies/ml。5×10<'5>细胞通过门静脉注射入9只经retrorsine处理的NOD/SCID鼠肝内，1mm<'3>肝组织植入9只NOD/SCID鼠肾包膜下。门静脉手术组5只动物存活，其中3只腹腔注射野生型HBV， 2只腹腔注射重组乙肝病毒载体；肾包膜移植组动物5只腹腔注射野生型HBV，4只腹腔注射重组乙肝病毒载体。嵌合体鼠体内hAAT浓度范围在990 ng到33ng，嵌合体鼠经腹腔注射野生型HBV后，血中HBV DNA水平为5×10<'3>copies/ml到0，HBsAg水平为0；而细胞培养基质中HBV DNA水平可达10<'7>copies/ml，HBsAg水平为200 ng到770 ng。肝组织标本HE染色可见嵌合体动物中典型的人肝细胞形态，呈苍白并有颗粒状表现；肾包膜下可见典型肝组织结构。HBsAg免疫组化显色呈阳性，免疫荧光探测HBsAg为阳性。用重组乙肝病毒载体感染人原代肝细胞和嵌合体动物，细胞培养基质中HBV DNA仅在第三天可探测到10<'1>copies/ml，HBsAg水平为0。经激光共聚焦可探测到细胞感染后第三天有GFP表达，第12天达高峰。感染重组病毒的动物血中仅在术后第三天可测到10<'1>copies/ml水平HBV DNA，HBsAg水平为0，免疫荧光探测肝组织中GFP为阳性。
结论:(1)分离，培养了人原代肝细胞并优化了培养条件，HBV可自然地有效地感染人原代肝细胞，因而成功建立了HBV感染的细胞模型。
(2)将人原代肝细胞移植到NOD/SCID鼠肝内，将人肝组织移植到鼠肾包膜下，建立了人-鼠嵌合体肝模型小鼠，并成功感染HBV，因而成功建立了HBV感染的动物模型。
(3)构建了携带外源报告基因的重组乙肝病毒载体，此载体有800bp的可用空间，可成功特异定向于体内或体外人肝细胞，所携带外源报告基因可高效表达，但不会表达病毒相关蛋白，此载体的构建成功为乙型肝炎治疗性载体的进一步研究奠定了基础。
(4)所构建的细胞模型和动物模型为乙型肝炎病毒生命周期，新的治疗药物，疾病发生学等的研究提供了有用工具。