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研究目的:葡萄糖是动植物碳水化合物的主要成分,葡萄糖的定量测定在生命科学中占有重要地位。现有的葡萄糖检测方法主要包括:高效液相色谱法、旋光度法、分光光度法、生物传感器法等。但这些方法普遍存在昂贵、操作复杂的缺点,因此构建一种高灵敏度、高选择性、快速简便的检测新方法有着重要的应用价值。近年来,葡萄糖氧化酶法检测葡萄糖具有准确、选择性高的特点,而被广泛应用于生物化学、临床化学及食品分析中葡萄糖的检测,但游离酶对pH和温度较敏感而易失活,不能重复利用,酶的固定化在很大程度上能够解决此类问题,本研究采用模板法合成了氨基化树枝状介孔二氧化硅纳米材料,用该材料来固定葡萄糖氧化酶,建立了固定化葡萄糖氧化酶检测葡萄糖的新方法,拓宽了卫生检测技术领域的新发展。研究方法:1.采用模板法,以三乙胺为碱源,合成树枝状介孔二氧化硅纳米粒子（DMSNS）,并用3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）对其修饰氨基,最终合成了氨基化树枝状介孔二氧化硅纳米粒子（DMSNS-NH2）,用此材料作为载体来固定葡萄糖氧化酶。探讨了固定葡萄糖氧化酶时的最佳反应条件,采用扫描电镜、透射电镜、红外光谱扫描仪、氮气吸附仪及热重分析仪对载体及固定化酶进行了表征。2.用固定化葡萄糖氧化酶对葡萄糖进行检测,探讨该方法检测葡萄糖的最佳反应条件,并对检测方法进行方法学评价,包括检测限的确定、对照实验、准确度、特异性、重复性等。最后用已建立的检测方法对实际样本如临床血液样本和饮料中的葡萄糖进行检测。采用SPSS 24.0对实验数据进行分析,结果用（?）±s表示。研究结果:1.扫描电镜和透射电镜图显示,本实验合成的氨基化树枝状介孔二氧化硅纳米粒子,呈分散的球形微粒,分散均一,粒径在200 nm左右,内有树枝状孔隙直通内部,整体开放性较好,可为酶的固定化提供更多的空间。红外光谱扫描图显示,在1636 cm-1处有-NH2的振动峰,这说明氨基已成功修饰到树枝状介孔二氧化硅上,在1646 cm-1和1526 cm-1处分别是酰胺I键和酰胺II键的吸收峰,说明葡萄糖氧化酶成功固定在氨基化树枝状介孔二氧化硅上。氮气吸附脱附曲线显示,氨基化树枝状介孔二氧化硅的比表面积和孔容分别为215.19m2/g,0.88 cm3/g,固定化酶的比表面积和孔容分别为165.06 m2/g,0.64 cm3/g,再一次说明葡萄糖氧化酶已经固定在该载体上。热重图谱显示,固定化酶重量总共损失了15%,而固定化酶重量损失达27%,这两者之间的差值即为固定的葡萄糖氧化酶量,进一步说明葡萄糖氧化酶成功固定在载体上。另外,固定条件在pH=5.0,固定时间为6.0 h,酶浓度为0.3 mg/mL时,固定效果最佳,蛋白载量达225.0 mg/g,酶活性达215.0 U/mg。2.固定化酶与游离酶酶学性质分析结果显示,游离酶和固定化酶的最适pH均为5.0,游离酶的最适温度为30℃,而固定化酶的最适温度为40℃,整体右移;在偏酸和偏碱性环境下,固定化酶的相对酶活性剩余60.0%,而游离酶仅剩40.0%;在温度为60℃环境中孵育2.5 h后,固定化酶活性剩余75.0%,保留了较高的相对酶活性,游离酶活性仅剩57.0%;储存2个月后,固定化酶活性剩余93.0%,而游离酶仅剩余76.0%。3.对固定化酶检测葡萄糖实验进行优化,确定检测的最佳条件为:最佳检测时间为20 min,最适固定化酶量为3.0 mg。方法学评价中,检测限为0.0014mg/mL,葡萄糖浓度在0.001 mg/mL0.500 mg/mL范围内线性关系良好,线性方程为y=4.9883x+0.0025,R2=0.9987,固定酶重复使用45次后,活性仍剩余80.0%以上。对照实验结果表明,本检测方法结果与国标相比无显著差异。验证实验的准确度,计算出相对标准偏差（Relative Standard Deviation,RSD）在1.60%7.40%之间,加标回收率在90%120%之间,说明方法的准确度良好。重复性实验中,日内变异率为2.56%7.14%,日间变异率为4.20%6.07%。说明此方法在检测葡萄糖时特异性良好,不受果糖,乳糖,麦芽糖,胆酸钠,抗坏血酸,尿酸等物质的干扰。在血液样本和饮料样本检测时,检测结果与实际值相符,表明检测方法可靠。研究结论:1.采用模板法,以三乙胺为碱源,制备出树枝状介孔二氧化硅,对其修饰氨基,合成了氨基化树枝状介孔二氧化硅纳米粒子,该材料分散均一,有树枝状孔隙,为酶的固定化提供了较大的空间。本研究用此材料作为载体,实现了对葡萄糖氧化酶的固定化,用固定化酶对实际样品进行测定。2.固定化酶与游离酶相比,其热稳定性,pH稳定性及储存稳定性均显著高于游离酶,重复使用性高,极大地提高了葡萄糖氧化酶的检测性能。3.本检测方法存在良好的线性关系,对血清样本和饮料样本检测时,结果准确快速、不受其他物质的干扰且性质比较稳定,可靠性较好。