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鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium，St）是一种非常重要的人畜共患病原菌，它是一种胞内侵袭性细菌并对黏膜有很强的嗜性。通过各种方法减毒的鼠伤寒沙门菌对宿主的致病性显著降低，但仍保留良好的侵袭力，不但可作为减毒疫苗，也可作为外源抗原的有效载体。目前，利用减毒鼠伤寒沙门菌作为裁体传递外源抗原基因疫苗已成为目前基因免疫研究的热点之一。减毒鼠伤寒沙门菌SL1344Δcrp由本实验室构建，它是利用重组自杀性质粒介导的细菌等位基因交换技术构建而成，不含任何抗性基因。本室已对其生长特性、耐药性、遗传稳定性及毒力等作出了评价，研究结果表明，该减毒株具有良好的稳定性和安全性；asd基因是鼠伤寒沙门菌的营养缺陷型基因，缺失后会导致细菌不能正常合成细胞壁而裂解死亡。如果将含有asd基因的质粒转入asd-缺失菌株中构成宿主-载体平衡致死系统，该菌则可恢复正常的生长能力。基于上述条件，为研制更加安全有效的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗，并将其开发为新型活疫苗载体，本研究在SL1344Δcrp的基础上，进一步缺失asd基因，构建鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔasd双基因缺失突变株，并对其生物学特性进行研究，进一步地应用该缺失株携带鸡新城疫（Newcastle disease，ND）的HN基因，为开发以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的口服基因工程疫苗奠定了基础。1.鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔasd缺失株的构建及筛选以χ7213（pREΔasd）为供体菌，鼠伤寒沙门菌SL1344Δcrp为受体菌，利用重组自杀性质粒介导细菌基因等位交换技术两步法筛选SL1344ΔcrpΔasd双缺失突变株，并通过PCR及测序进行鉴定，结果表明该双缺失株构建成功。2.缺失株SL1344ΔcrpΔasd的生物学特性研究该缺失株SL1344ΔcrpΔasd需要在DAP存在下才能生存，在对该菌进行各项生物学特性研究中，均加入了DAP。研究发现，该双缺失株的表型性状与强毒株相比发生了明显变化，SL1344ΔcrpΔasd失去了利用麦芽糖、丙三醇、山梨醇等的能力，也不能分解H2S，但仍保留了利用葡萄糖、半乳糖等的能力，这些都与亲本菌株SL1344Δcrp保持一致；双缺失株SL1344ΔcrpΔasd与亲本株SL1344Δcrp生长速度都明显慢于强毒株SL1344，而双缺失株SL1344ΔcrpΔasd由于补充有外源DAP，其生长速度与亲本株SL1344Δcrp相差不大；双缺失株的血清型没有发生改变，且能稳定遗传缺失后的Δasd基因；其毒力较野毒株SL1344降低了约105倍。3.重组减毒鼠伤寒沙门菌NDV-HN菌株的构建与鉴定以pMD18-T-HN为模板，通过PCR扩增出鸡新城疫HN基因片段，定向插入原核表达载体pYA3493中，将重组表达质粒pYA3493-HN转入减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔasd，通过双酶切和PCR对质粒进行鉴定。结果表明携带鸡新城疫HN基因片段的重组减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔasd（pYA3493-HN）构建成功；将该重组菌株在LB液体培养基中连续传代60代，HN基因能够稳定遗传，从而为开发鸡新城疫的口服基因工程活载体疫苗奠定了基础。