论文部分内容阅读
猪源性外来病能够通过国际间贸易交流、野生动物携带及昆虫媒介传入我国,一旦传入将会给我国养猪业带来严重的损失,甚至是公共卫生问题。本研究以非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)、尼帕病毒(Nipahvirus,NiV)、水疱性口 炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)、塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus,SW)以及口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)5 种猪源性病毒为研究对象,设计特异性扩增引物,利用多重PCR扩增得到带有修饰的扩增产物,然后与微球杂交、孵育,并验证方法的敏感性和特异性,以期构建多种猪源性外来病的液相芯片检测体系。主要研究结果如下:1.多种猪源性外来病单重PCR体系的建立建立的ASFV、NiV、VSV、SW和FMDV的单重PCR检测方法,敏感性结果最低检测量分别为 39.0copies/μ L、4.6copies/μ L、29.9copies/μ L、36.8copies/μ L和20.9copies/μ L;特异性结果为每种病毒的单重PCR检测方法只对目的基因特异性扩增,对其余4种对照病原无扩增。2.多种猪源性外来病多重PCR体系的建立在单重PCR的基础上,对多重PCR退火温度进行优化,确定最佳多重PCR反应条件和检测体系。敏感性结果中ASFV、NiV、VSV、SVV和FMDV扩增单一质粒时最低检测量分别为3.90x102copies/μL、4.60x104copies/μL、2.99x104copies/μL、3.68x102copies/μL、2.09x102copies/μL;扩增混合模板时 ASFV最低检测量为 3.90x103copies/μL、SVV 最低检测量为 3.68x104copies/μL、FMDV最低检测量为2.09x103copies/μL,NiV和VSV在凝胶电泳图上不易区分先不做分析。特异性实验结果表明建立的多重PCR检测方法只扩增特异性目的条带。3.多种猪源性外来病液相芯片检测方法的建立将多重PCR扩增产物与微球杂交,再与链霉亲和素藻红蛋白孵育,孵育后利用Luminex 200液相芯片仪检测荧光中位值。对杂交时间、杂交温度进行优化确定最佳杂交条件。所有阳性判定结果的MFI值均≥3倍阴性对照,且阴性对照≤300。ASFV、NiV、VSV、SVV和FMDV的敏感性实验结果中单一质粒液相芯片检测最低检测量分别为 39.0copies/μL、4.60x1 04copies/μL、2.99x103copies/μL、36.8copies/μL和2.09x102copies/μL;混合质粒液相芯片检测最低检测量分别为3.90x102copies/μL、4.60x104copies/μL、2.99x105copies/μL、3.68x103copies/μL 和2.09x102copies/μL。液相芯片检测方法只对研究的五种病毒特异性反应,与其余对照病毒无交叉反应。同批次3组重复实验的变异系数均小于0.2%。本实验成功建立了 ASFV、NiV、VSV、SVV和FMDV五种病毒的液相芯片检测方法,为猪源性病毒病的快速、高通量检测提供技术支持,也为其他病原体液相芯片检测方法的建立提供思路。