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一 介绍骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一个常见的关节疾病,主要累及负重关节。其中,OA的主要特点是关节软骨逐渐退变、关节疼痛和功能障碍。但是,越来越多的数据表明,软骨血管生成在OA发展中发挥了重要作用。然而,OA进展过程中软骨血管生成导致关节软骨退变确切机制仍是未阐明。二 目的通过构建软骨细胞特异Tsc1敲除小鼠,探讨其与H-型血管的变化,及该血管与OA的相互作用,并旨在阐明OA过程中血管的类型、来源、作用。三 材料方法2月龄雄性C57BL/6小鼠、DMM手术的Tsc1 CKO组小鼠(一部分予以生理盐水治疗,一部分予以贝伐珠单抗治疗)。免疫组化、蛋白印迹检测相关蛋白。检测原代软骨细胞和ADTC5的VEGF-A表达及血管变化。四 结果1.在OA过程中,软骨下骨的H-型血管增多。通过CD31和Emcn免疫共荧光,我们发现OA小鼠软骨下骨的H-型血管相对正常小鼠发生明显改变。我们观察到OA小鼠软骨下骨的H-型血管明显增多。而且,我们观察到在OA小鼠中,大量蛋白多糖丢失和关节软骨退变。老年的小鼠是比较容易发生OA,其软骨下骨的H-型血管明显增多。2.在OA过程中,关节软骨VEGF-A能促进血管形成。免疫组化检测中,OA小鼠的软骨细胞VEGF-A表达增多。在体外OA细胞模型,ELISA实验检测出其收集的原代软骨细胞上清液VEGF-A浓度增高。而且,OA软骨细胞上清液能促进人脐静脉内皮细胞血管形成。3.软骨细胞mTORC1活性促进软骨下骨H-型血管和OA的发生。我们观察到Tsc1 CKO组小鼠软骨下骨的H-型血管明显增多,而正常组和Tsc1 CKO Rapa组小鼠的明显减少。Tsc1 CKO组小鼠的蛋白多糖丢失和关节软骨退变,而正常组和Tsc1 CKO Rapa组小鼠关节软骨基本上没有发生改变。然后,我们对8周龄大的正常组、Tsc1 CKO组和Raptor CKOER小鼠小鼠进行DMM手术诱导OA,并通过免疫组化检测其关节软骨mTORC1活性。相似的,免疫组化分析得出,术后5周的上述3组小鼠,Tsc1 CKO组小鼠软骨下骨的H-型血管明显增多,而正常组和Raptor CKOER组减少。术后5周,Tsc1 CKO组小鼠蛋白多糖丢失明显和软骨破坏明显,而Raptor CKOERR组小鼠显示出很少的软骨破坏和保留更多的蛋白多糖。4.在体外,mTORC1活性促进软骨细胞VEGF-A产生和促进血管形成。免疫组化染色显示,8周龄时,Tsc1 CKO组的软骨细胞的VEGF-A强,而正常组和Tsc1 CKO Rapa组小鼠表达弱。在体外,Tsc1 CKO组小鼠软骨细胞上清表现出比正常组更多的VEGF-A的表达,而正常组和Tsc1 CKO Rapa组没有明显差异。此外,Tsc1 CKO组小鼠上清显著增加血管生成,而Tsc1 CKO Rapa组保持少量血管生成与正常组相类似。同样的,Tsc1 siRNA转染过的细胞分泌更多VEGF-A,但与正常组和雷帕霉素治疗组没有显著性差异。5.软骨细胞mTORC1活性调节的H-型血管对OA起着重要作用。与注射生理盐水Tsc1 CKO组比较,贝伐珠单抗减少H-型血管数量。贝伐珠单抗治疗后,保持与正常组相当的血管数量。此外,贝伐珠单抗能减少蛋白多糖的丢失和软骨退变。术后5周,与注射生理盐水的造模后Tsc1 CKO组比较,贝伐珠单抗减少H-型血管数量。贝伐珠单抗治疗后,保持与造模后正常组相当的血管数量。并且,贝伐珠单抗能减少造模后Tsc1 CKO组蛋白多糖的丢失和软骨退变。6.增加关节营养上调软骨细胞mTORC1活性。在1小时内,不管是ATDC5软骨前体细胞还是原代软骨细胞,p-S6(S235/236)随着含营养处理的时间增长而表达增多。Western印迹,贝伐珠单抗治疗后的OA小鼠关节软骨p-S6(S235/236)表达减少;免疫组化染色,也观察到贝伐珠单抗治疗后的OA小鼠关节软骨p-S6(S235/236)表达减少。7.抑制关节血管可延缓OA发生发展。在OA小鼠中,贝伐珠单抗治疗能减少蛋白多糖的损失和软骨退变和减少H-型血管数量。贝伐珠单抗后的OA小鼠,LC3B表达升高。而且,贝伐珠单抗后的OA小鼠,MMP13,ColX,Runx2表达较少,软骨细胞死亡的减少。这些结果表明,增加血管生成可以激活mTORC1信号,并促进OA的发展。五结论1.在OA过程中,软骨下骨的H-型血管增多;随着年龄老年化,软骨下骨的H-型血管呈增多趋势。2.关节软骨细胞mTORC1活性上调促进软骨下骨H-型血管形成和加重OA的发生发展;反之,关节软骨细胞mTORC1活性下调抑制软骨下骨H-型血管形成和延缓OA的发生发展。3.mTORC1正调控关节软骨细胞内VEGF的表达,对软骨下骨H-型血管形成发挥重要的调控作用。4.抑制软骨下骨H-型血管形成,减少营养,能下调关节软骨细胞mTORC1活性,并延缓OA的发生发展。综上所述,软骨细胞内mTORC1可通过VEGF-A调节软骨下骨H-型血管形成。而且,过多的H-型血管可能通过激活软骨细胞mTORC1信号,促进OA的发生发展。