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研究目的:
本课题组前期研究揭示,Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)及其信号转导途径参与了抗磷脂抗体／抗原复合物(anti-beta-2-glycoproteinⅠ／beta-2-glycoproteinⅠ,anti—β2GPI／β2GPI)诱导人单核细胞株THP-1表达组织因子(tissue factor,TF)的过程,且部分依赖膜联蛋白A2(Annexin A2,ANX2),成为抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome,APS)血栓形成的机制之一。本论文重点探讨TLR4引发的信号通路中的关键分子-肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor6,TRAF6)在此过程中的作用及可能的调节机制。
研究方法:
(1)利用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测anti-β2GPI／β2GPI诱导THP-1细胞TF mRNA的表达,采用TF活性测定试剂盒检测细胞TF活性。
(2)RT-qPCR、Western蛋白印迹、免疫共沉淀检测anti-β2GPI／β2GPI诱导THP-1细胞表达TRAF6水平及其活化形式。
(3)用蛋白酶体途径抑制物-MG-132预处理THP-1细胞,观察anti-β2GPI／β2GPI对THP-1细胞TRAF6和TF表达的影响。
(4)RT-qPCR、Western蛋白印迹检测anti—β2GPI／β2GPI对TRAF6相关调控蛋白(TRAF4及锌指蛋白A20)的表达。
(5)利用本课题组已有的ANX2 RNA干扰慢病毒(LV-RNAi-ANX2)感染THP-1细胞、TLR4／MD-2途径抑制物--紫杉醇(paclitaxel)以及白介素-1受体相关激酶1／4阻断剂(IL-1 receptor-associatedkinase1／4 inhibitor,IRAK1／4 inhibitor)预处理THP-1细胞,观察对TRAF6、TRAF4及A20蛋白表达的影响。
研究结果:
(1)Anti-β2GPI／β2GPI(100μg／mL)能够刺激THP-1细胞表达TFmRNA及活性,与对照相比差异显著(P<0.05)。
(2)Anti-β2GPI／β2GPI(100μg／mL)使THP-1细胞TRAF6 mRNA和蛋白(总蛋白和泛素化的蛋白)表达均增加,并显示时间相关性,分别在刺激15 min和30 min时表达至高峰。
(3)MG-132(5μmol／L)明显抑制anti—β2GPI／β2GPI对THP-1细胞TRAF6 mRNA和蛋白的刺激效应及TF的诱导表达。
(4)Anti-β2GPI／β2GPI(100μg／mL)刺激THP-1细胞后,TRAF4和A20 mRNA水平均增高,于刺激15 min达高峰。TRAF4蛋白表达在30 min时达到高峰,后逐渐降低,而A20蛋白显示逐渐升高,持续至12 h。
(5)LV-RNAi-ANX2感染的THP-1细胞TRAF6蛋白表达降低,与未干扰相比差异显著(P<0.05)；0.1μmol／L-1μmol／L紫杉醇能抑制TRAF6和TRAF4以及A20的刺激效应；不同浓度IRAK1／4 inhibitor可以干预TRAF6、TRAF4及A20蛋白的表达。
结论:
(1)单核细胞株THP-1经anti-β2GPI／β2GPI刺激后,信号分子TRAF6被诱导表达并发生泛素化,最终促进细胞表达TF,从而参与APS血栓形成机制；MG-132可以干预TRAF6和TF的表达,为APS血栓形成的预防及治疗提供新思路。
(2)在anti-β2GPI／β2GPI诱导THP-1细胞表达TF所涉及的信号转导通路中,TRAF6作为关键分子而发挥作用,ANX2、TLR4／MD-2、IRAKs为其上游信号分子,而TRAF4和A20可能对TRAF6起自身调节作用。