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目的: 构建弓形虫重组热休克蛋白70（Recombinant Toxoplasma gondii HSP70，rT.g.HSP70，以下简称T.g.HSP70），结合体内外实验探讨T.g.HSP70诱导弓形虫感染小鼠急性肝脏损伤的作用及其对TLR4/MAPK信号通路的影响。 方法: 第一部分: 对T.g.HSP70基因序列进行亚克隆，设计合成T.g.HSP70引物，采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法扩增其基因片段，获得T.g.HSP70基因编码片段，经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切，与质粒pET15b连接后进行PCR鉴定，即得T.g.HSP70粗品，进一步层析纯化后浓缩，进行蛋白浓度的测定，使用10％SDS-PAGE分析，制备得到T.g.HSP70蛋白。 第二部分: (1)体内实验:将b0只(20±2)g的C57BL/6雌性小鼠随机均匀分为4组，每组5只，分别为:正常组(Normal)、弓形虫感染组（T.gondii）、弓形虫热休克蛋白70组（T.g.HSP70）、模型组（T.gondii+T.g.HSP70）。除正常组与弓形虫感染组外，其余各组小鼠经口感染弓形虫弱毒株Fukaya包囊10个/只，于感染第7天腹腔注射给予T.g.HSP70（50μg/只），观察小鼠死亡率，6h后将全部小鼠摘眼球采血，收集血清，颈椎脱臼处死小鼠，剥离肝脏，取肝称重，计算肝指数，ELISA法测定血清中谷氨酸-丙酮酸转氨酶(ALT)，天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平以及肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量;采用比色法检测肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;HE染色法观察肝脏的病理变化。 (2)体外实验:培养小鼠正常肝细胞NCTC1469，以4×105的细胞密度接种于6 cm培养皿中，用含有10％ FBS的DMEM高糖培养基孵育，分为正常组(Normal)，弓形虫感染组（T.gondii），弓形虫热休克蛋白70组（T.g.HSP70），模型组（T.gondii+T.g.HSP70）。除正常组与弓形虫热休克蛋白70组外，其余组按弓形虫:细胞为5∶1的比例感染RH株速殖子（2×106个/皿），4h后，洗去游离的弓形虫，换液处理24h，除Normal组与T.gondii组外，其余各组加入T.g.HSP70诱导30 min，观察各组细胞变化，收集细胞上清和沉淀，并按试剂盒要求分别提取细胞总蛋白、核/胞浆蛋白以及细胞RNA。最后，用MTT法检测肝细胞增殖率;比色法检测细胞上清中MDA的含量和SOD的活性;用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测细胞中Toll样受体4(Toll like receptor4，TLR4)，丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)等蛋白的表达;用RT-PCR法检测细胞中TNF-α mRNA的表达水平。 结果: 第一部分: 通过对T.g.HSP70基因的亚克隆，设计合成了T.g.HSP70引物以及T.g.HSP70粗品，并将上述T.g.HSP70粗品再与抗T.g.HSP70 IgG mAb结合的Sepharose4B吸附柱进一步层析纯化，透析浓缩后，成功制备得到T.g.HSP70蛋白。 第二部分: (1)体外实验结果表明:通过给予不同浓度T.g.HSP70诱导小鼠死亡率的实验结果表明，本实验所选最适T.g.HSP70浓度为50μg/只;与正常组相比，小鼠模型组肝脏指数和ALT、AST水平明显升高(P＜0.01;P＜0.05)，表明肝脏受损，急性肝损伤模型建立成功。同时，给予T.g.HSP70刺激后，模型肝脏中MDA以及炎症因子TNF-α的含量均显著升高(P＜0.01; P＜0.05)，SOD活性显著下降（P＜0.01;P＜0.05）;小鼠肝脏HE染色结果表明，与正常组相比，模型组出现了肝细胞肿胀、凋亡以及显著的胞质间隙增生，伴有炎性细胞浸润，而其他组肝脏的病理学未见明显炎症病变及细胞浸润，这表明T.g.HSP70成功诱导了弓形虫感染小鼠急性肝损伤，其损伤机制可能与机体脂质过氧化以及诱导炎症因子的释放有关。 (2)体内实验结果:MTT细胞毒性实验结果显示，T.g.HSP70诱导肝细胞损伤模型的浓度为25μM，50μM，100μM时均对细胞无毒性;生化指标检测结果表明，模型组细胞上清中ALT/AST含量较正常组明显升高，肝细胞受损;Western Blotting实验结果表明，与正常组相比，T.g.HSP70诱导30min后，模型组中TLR4、p-MAPK的表达明显增强，即T.g.HSP70增强了各个蛋白的表达;RT-PCR结果显示，模型组中TNF-α mRNA的表达水平较正常组显著增强，这从分子水平说明T.gHSP70诱导的弓形虫感染小鼠急性肝损伤机制与TLR4-MAPK信号通路的激活有关。 结论: T.g.HSP70能够加速诱导弓形虫感染小鼠导致急性肝损伤，其可能的作用机制为:T.g.HSP70增加了小鼠肝脏组织中MDA的含量，降低了SOD活性，打破了氧自由基反应与脂质过氧化反应的动态平衡，从而致使机体受损;T.g.HSP70能够激活TLR4/MAPK信号通路，进而促进炎症因子TNF-α的产生，导致严重的肝损伤。