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脂肪酶是一个超级基因家族，广泛存在于动植物和微生物中。脂肪酶主要分为两类，即GXSXG脂肪酶和GDSL脂肪酶。GDSL脂肪酶具有脂水解活性，在食品、香料、化妆品等行业中具有潜在的应用价值。而且，植物中GDSL脂肪酶可能在调控植物生长和发育中扮演重要角色。油菜是十字花科油料作物，研究油菜中GDSL脂肪酶在油脂代谢过程中的作用将有助于揭示其与植物生长发育的关系，同时也为油菜脂肪酶的应用打下理论基础。
本研究通过对拟南芥GDSL脂肪酶基因及其蛋白编码序列的生物信息学分析、油菜GDSL脂肪酶基因全长cDNA序列的克隆和表达，以及对BnLIPl基因进行原核表达等研究，得出以下结果：
1)对拟南芥GDSL脂肪酶基因及其编码的氨基酸序列的生物信息学特征进行了系统的分析。基于生物信息学数据库的资源，获得了99个拟南芥GDSL脂肪酶基因，对应107个非冗余cDNA序列。研究结果显示，它们的基因结构复杂，分别含有1～13个内含子，而且内含子大小从几十bp到1kb不等。这些基因在拟南芥染色体上呈无规律分布，有的GDSL脂肪酶基因在染色体的某些区域如染色体I的短臂近着丝点区域、长臂中部及近端粒区域集中分布，也有的基因在染色体上呈串联分布。序列同源性比对发现，编码不同GDSL脂肪酶蛋白的氨基酸序列具有相对保守的区域，但是序列之间的同源性并不高。在进化关系上，拟南芥GDSL脂肪酶分为三组，分别由28、40和39个成员组成。通过结构域分析发现，拟南芥中大部分GDSL脂肪酶具有典型的GDSL脂肪酶的特征，即它们的GDSL脂肪酶结构域靠近N一端，前面的氨基酸序列可能作为信号肽介导蛋白的分泌。但是，个别GDSL脂肪酶的GDSL结构域在N-端或位于蛋白序列的中部，而有的氨基酸序列中同时具有多个GDSL脂肪酶的结构域。亚细胞定位预测分析结果显示，有99个脂肪酶的N一端含有长度为6～113个氨基酸的信号肽，它们可能负责介导蛋白定位到内质网，然后分泌到细胞的其它部位甚至胞外。另有2个GDSL脂肪酶蛋白很可能分别定位到线粒体和叶绿体，4个蛋白中没有明确的亚细胞定位信号。由此可见，拟南芥GDSL脂肪酶的确是一个大家族，各成员在序列、基因结构、结构域的位置、亚细胞定位特征等方面都具有不同程度的多样性。拟南芥的大部分GDSL脂肪酶基因结构复杂，序列同源性不高，GDSL脂肪酶结构域靠近N一端，而且具有分泌信号。基于目前的研究报道，这些GDSL脂肪酶很可能在拟南芥的种子萌发、花发育及抗逆反等过程中发挥重要作用。
2)从油菜种子萌发的黄化幼苗中克隆了BnLIPl全长cDNA，其大小为1318bp，推导该序列编码一个含389个氨基酸残基、分子量为43.32kDa的蛋白。BnLIPl基因序列与拟南芥GDSL脂肪酶基因序列具有较高的同源性，其中与Arab-1的同源性达70％；而在氨基酸水平上BnLIPl蛋白与Arab-1的同源性达82％。通过氨基酸序列的多重比对发现，BnLIPl的氨基酸序列与部分已报道的植物GDSL脂肪酶具有多个保守的区域，其中含有丝氨酸活性位点的GDSL-motif靠近蛋白的N-端，该motif中Ile-42取代了Leu；同时推测Ser-41、Asp-180、His-348三者组成具有催化活性的三联体。由此可见，所获得的cDNA编码的蛋白具有GDSL脂肪酶的一级结构特征，而且该蛋白具有GDSL脂肪酶结构域，因此推测BnLIPl是GDSL脂肪酶家族的成员。预测发现，BnLIPl蛋白具有4个N-糖基化位点，其在进化上与拟南芥Group Ⅲ的成员尤其是Arab-1的亲缘关系最近，属于Group Ⅲ蛋白家族。此外，还克隆了该基因的基因组序列，该序列长度为1601bp，含有4个内含子，与拟南芥中的大多数GDSL脂肪酶基因类似，其基因结构比较复杂。同时，Southern杂交分析表明其很可能以多拷贝的形式存在于油菜基因组中。
组织器官表达分析结果表明，BnLIPl基因在油菜休眠种子以及萌发后3天之前的材料中不表达，而从萌发后第3天开始该基因有强烈的表达。具体而言，萌发第3天和第4天的表达水平稳定，到萌发第5天时的表达量最大，随后则趋于减弱，BnLIPl基因的表达随种子萌发而发生变化。因此，BnLIPl基因很可能参与了种子萌发过程中的代谢活动。同时还发现其在成熟植株的不同组织器官中的表达表现出明显的差异，在根和未成熟的果荚中的表达明显弱于其它组织器官中的表达，而在花和花蕾中的表达量很高，这说明BnLIPl基因可能在植株的开花、果荚发育等过程中发挥重要的作用。因此，BnLIPl基因不仅仅与种子萌发有关，还可能参与成花、开花、果荚发育等生理过程。这说明BnLIPl编码的脂肪酶很可能参与油脂的基础代谢，而不同于萌发阶段特异表达的脂肪酶。
3)从油菜种子萌发的黄化幼苗中克隆了BnLIP2基因的全长cDNA，其大小为1300bp，推导该序列编码一个含有373个氨基酸残基、分子量为41.27kDa的蛋白。BLASTn分析表明，其cDNA序列与拟南芥GDSL脂肪酶基因的同源性为63.5％，而与Arab-1和BnLIPl的同源性较低。此外，与看麦娘脂肪酶基因、水稻脂肪酶基N(GenBank Acc.No.ACl24150)的同源性很低。BnLIP2蛋白的氨基酸序列与拟南芥GDSL脂肪酶(Acc.Nos.NP 174179，NP 174188)的同源性分别为77.5％和59.5％，与油菜(AAX58135)、水稻(AAS91011)、看麦娘(CAG27610)、燕麦(AAT11017)、萝芙木(AAW88320)的GDSL脂肪酶的同源性分别为59％、47.6％、46.5％、39％和37％。此外，与洋地黄、苜蓿、橡胶树等物种的GDSL脂肪酶具有较低的同源性。氨基酸序列多重比对结果显示，与BnLIPl类似，BnLIP2同样具有GDSL脂肪酶的保守区序列，靠近N-端的GDSL-motif中Ile-37取代了Leu，其具有催化活性的三联体可能由Ser-36，Asp-174(或Asp-326)和His-329组成。推测BnLIP2蛋白属于GDSL脂肪酶家族。在氨基酸水平上，BnLIP2与BnLIPl只有59％的同源性，表明它们由不同的GDSL脂肪酶基因编码。此外，BnLIP2蛋白中同样含有GDSL脂肪酶结构域(PF00657)，在进化上也属于Group III家族，而且与拟南芥GDSL脂肪酶(Acc.No.NP-174179)的进化关系最近，在进化上与BnLIPl也较近。分析发现，在Group III家族成员中，分类地位越近的物种，其GDSL脂肪酶的进化关系也越近，比如十字花科中拟南芥和油菜的GDSL脂肪酶，禾本科植物小麦和燕麦的GDSL脂肪酶等。Southern杂交分析结果表明BnLIP2基因为低拷贝基因。
利用半定量RT-PCR对BnLIP2基因进行了表达研究，结果发现，在萌发3天之前的样品中未检测到BnLIP2基因的表达，其表达开始出现在萌发3天(3DAG)的样品中，在这一点上BnLIP2基因与BnLIPl基因相似。然而，在种子萌发后期二者的表达特征具有明显的差异。BnLIP2基因的表达在萌发后第3天到第5天维持较弱的水平，直到萌发后第6天该基因的表达量剧增；而BnLIPl基因在萌发后第3天和第4天的表达量很高，其表达在萌发第5天时达到最高值。可见，种子萌发期间BnLIP2基因的大量转录发生在BnLIP1基因之后，而且转录高峰也相应滞后。这意味着两个基因都参与了种子萌发过程，但其表达具有时间特异性。在成熟植株的不同组织器官中BnLIP2基因的表达也具有明显差异。BnLIP2基因在茎、叶、花、未成熟的果荚，以及花蕾等组织中都有表达，其中在花蕾中的表达量最高，其次是在发育的果荚中，再次是在花和叶中，而在茎中的表达最弱。然而，BnLIP1基因在果荚中的表达最弱，而在茎中的表达量高。更有意思的是，在成熟植株的根中检测不到BnLIP2基因的表达，而．BnLIP1基因在根中有明显的表达。这些研究表明，二者在成熟植株不同组织器官中，尤其是在根中的表达差异明显。同时，在正常生长幼苗的根中同样检测不到BnLIP2基因的表达。这说明BnLIP2基因在植株正常生长发育条件下很可能并不参与根的生长和发育。
为了进一步研究BnLIP2基因在根中的表达情况，用甲基茉莉酸(MeJA)、水杨酸(SA)和萘乙酸(NAA)对4周龄幼苗的根部分别进行了处理，结果未检测到该基因在根部的表达。由此可见，上述诱导子并不能诱导BnLIP2基因在植株根中的表达。因此BnLIP2基因很可能并不参与在上述诱导子对根部的诱导反应。这是首次揭示油菜中GDSL脂肪酶基因的这一特性，特别是发现了BnLIP2基因在根中不表达的现象，而且其表达也不受某些诱导子的诱导。上述组织器官表达分析表明，BnLIP1基因可能比BnLIP2基因在油菜植株的生长发育中发挥更广泛的作用。
4)为了进一步研究BnLIPl基因的功能，构建了含BnLIPl基因的pET32a(+)大肠杆菌表达载体，在大肠杆菌中成功表达了BnLIPl蛋白，首次实现了油菜GDSL脂肪酶基因在原核系统中的表达。
综上，本研究表明，拟南芥GDSL脂肪酶基因是一个大家族，各成员之间具有明显的多样性，而Group III的成员可能在种子萌发过程中发挥重要作用。本研究从油菜种子萌发的黄化幼苗中克隆了属于GDSL脂肪酶基因家族的基因BnLIPl和BnLIP2，并对其进行了表达研究，为进一步研究其生化功能打下了基础。