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本论文面向结核、副结核等危害严重的分枝杆菌疫病诊断需求,应用实时荧光PCR和液相芯片、变性高效液相色谱(DHPLC)新型高通量分子生物学检测技术原理,针对结核分枝杆菌复合群(MTC)、结核分枝杆菌(MT)、牛分枝杆菌(MB)、副结核分枝杆菌(MAP)和鸟分枝杆菌(MA)等多种重要致病性分枝杆菌或菌群,开展快速检测试剂盒与高通量鉴别检测方法研究:
1、针对上述五种重要致病性分枝杆菌或菌群分别建立特异荧光PCR检测方法并形成试剂盒。多种菌种特异的荧光PCR方法为国内首次建立。针对MTC、MT、MB、MAP和MA建立了六套菌种或菌群特异的荧光PCR方法;建立了各种临床样品的前处理和核酸提取方法;将核酸提取试剂和荧光PCR试剂组装形成试剂盒。对13种共54株分枝杆菌标准株和分离株、25种微生物对照菌株和动物基因组DNA样品的检测结果显示,各试剂盒均能特异检测目标菌种。试剂盒检测敏感性达每个反应单个基因拷贝或每个反应单个菌细胞。组内检测变异系数和组间检测变异系数分别达1.1％～2.0％和2.6％～4.5％,批间检测变异系数达1.8％～8.7％。采用荧光PCR试剂盒从156份人痰样中检出MTC、MT和MA阳性,总体检出率(80.1％)显著高于培养法(46.2％);检出49份结核疑似牛临床样品呈MTC和MB阳性,而培养法的阳性率为51％(25/49);从28份动物粪样中检出15份呈MAP阳性,培养法检出12份。MAP荧光PCR试剂盒与ELISA方法对92份牛血样的检测符合率达72.8％。荧光PCR反应仅需时1.5小时。
2、在国内外首次建立多种重要致病性分枝杆菌xMAP液相芯片高通量鉴别检测方法,实现快速、灵敏、准确与高通量鉴别检测。针对上述五种致病性分枝杆菌或菌群设计筛选六套特异扩增引物和探针组合,建立各种组合多重液相基因芯片检测方法。根据检测需求,主要检测验证了三套四重液相基因芯片检测方法系列。三套四重方法均能准确鉴别分枝杆菌目标菌种(群),检测敏感性达每个反应101～102基因拷贝或6～20个菌细胞。四重方法的重复性试验组内变异系数和组间变异系数均小于10％。采用四重液相基因芯片方法,从131份人痰样中检出MTC、MT和MA阳性,总体检出率(75.6％)高于培养法(38.9％);从39份结核疑似牛组织样品中检出MTC和MB阳性,总体检出率(94.9％)高于培养法(53.8％);另从29份呈MAP荧光PCR阳性的牛血样中检出24份阳性。对混合模板的检测试验证实多重液相基因芯片方法能鉴别检测不同菌种混合感染。采用六重液相基因芯片方法实现了单管反应同时鉴别检测四种致病菌的六个目标基因。多重液相基因芯片检测反应可在2.5小时内完成。
3、在国内外首次针对多种重要致病性分枝杆菌建立多重PCR-DHPLC高通量鉴别检测方法。针对上述五种致病性分枝杆菌或菌群的六个目标基因分别设计筛选DHPLC特异扩增引物,建立多重PCR-DHPLC检测方法,获得六种目标基因DHPLC特征分析图谱。主要检测验证了三套四重方法。四重PCR-DHPLC特征检测图谱特异、稳定,均能准确鉴别混合模板携带的多种目标基因。检测敏感性达每个反应102～103基因拷贝、或20～100个菌细胞。采用四重PCR-DHPLC从131份人痰样中检出MTC、MT和MA阳性,检出率(57.3％)高于培养法(38.9％),从39份结核疑似牛组织样品中检出MTC和MB阳性,检出率(84.6％)亦高于培养法(53.8％);另从29份呈荧光PCR检测阳性的牛血样中检出19份MAP阳性。四重PCR-DHPLC检测反应可在2小时内完成,可连续自动化分析上百份样品。
4、通过采用PCR-DHPLC体系扩增引物,本论文提供特异检测鉴定重要致病性分枝杆菌的常规PCR方法。
5、运用所建立的方法对重要经济动物开展致病性分枝杆菌感染调查,并探讨疫病防控和进出境检验检疫监管措施。对进口食蟹猴和广东地区3个大型注册猴养殖场进行监测,采用荧光PCR和液相基因芯片方法检出MAP阳性率分别达7.2％和6.3％,检出MA阳性率均达2.0％。对广东地区6个奶牛养殖场进行监测,采用荧光PCR和液相基因芯片方法从奶样中检出MAP阳性分别达4.4％和2.4％,从某养殖场检出MAP阳性分别达25％和22％。从24头份皮试阳性猴的血样中检出16份呈MTC和MB阳性、检出3份MAP阳性和2份MA阳性,提示猴结核皮试存在假阳性。根据监测情况并结合国内外政策措施提出以下建议:重视对食用动物进行副结核病的检疫和监控,建立养殖场副结核监测制度;对进出境猴开展致病性非结核分枝杆菌感染监测;加强奶制品安全监控,将MAP等致病性分枝杆菌检测列入食品安全监控计划;综合运用多种检测技术手段,重视发挥分子生物学检测技术优势。