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银香菊(Santolina chamaecyparissus L.)为多年生草本芳香植物,多生长于地中海沿岸以及长江以南地区,含有多种挥发性活性成分,具有显著的抗菌、抗肿瘤、抗病毒等药理作用。在我国,银香菊多被用于制作成驱虫避蚊药草或作为园林景观装饰使用,虽然银香菊具有非常丰富的药理活性成分,但由于其多数为野生,缺乏专业的栽培与种质资源保护,草本形态易受气候变化、病虫害等诸多不利因素影响,使得银香菊植物资源与活性成分的深入研究一直被忽视,导致银香菊植物产业化开发与利用进展缓慢。为了解决上述问题,本文建立了银香菊组织培养再生技术体系,通过激素诱导促进挥发性成分合成增量,利用转录组测序技术对激素诱导后银香菊再生苗中差异性表达基因进行功能注释,总结银香菊挥发性成分生物合成通路并对其候选酶基因的表达进行验证。本论文的主要研究内容及结果如下:1、建立了银香菊挥发性成分GC-MS检测分析方法色谱条件:所用毛细管柱为DB-5MS 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm;载气为高纯氦气,流速为1mL/min。不分流模式,进样口温度为250℃。柱温箱的升温程序为:40℃保持2 min,然后以5℃/min速度升至180℃,保持2 min,继而以5℃/min速度升至240℃,保持 5 min。质谱条件:电离方式EI,离子能量70 eV;质谱接口温度250℃,离子源温度230℃,质量扫描范围为35-550 U。结果表明在银香菊中共鉴定得到48个挥发性物质,富含倍半萜类化合物,本方法重复性好、精确度高,适用于后续对银香菊中挥发性成分的分析检测。2、建立了银香菊组织培养再生体系并对其挥发性成分进行检测分析(1)银香菊外植体最佳消毒方式为依次使用75%乙醇与1%次氯酸钠溶液对银香菊茎段进行消毒,接种于MS培养基培养10天后,统计银香菊外植体存活率为95%。(2)银香菊愈伤组织最佳诱导培养基为MS+0.2 mg L-1 NAA+1.0 mg L-1 BA+30 g L-1蔗糖+8 g L-1琼脂,调节培养基pH为5.8,统计愈伤组织诱导率为82%。(3)银香菊最佳丛生芽诱导培养基为MS+0.04 mg L-1 BA+0.1 mg L-1 NAA,+30 g L-1蔗糖+8gL-1琼脂,调节培养基pH为5.8,在25±1℃的冷白荧光灯,光照强度为1800 Lx,16 h/天的光照下培养6周可得到生长状态最佳及数量最多的银香菊丛生芽。(4)以丛生芽生根的长度、数量、生根诱导率和生物量为指标考察培养基中添加不同浓度的NAA对银香菊丛生芽生根的影响。实验结果表明银香菊最佳生根诱导培养基为MS+0.1mg L-1NAA+30g L-1蔗糖+8gL-1琼脂,调节培养基pH为5.8,在25±1℃的冷白荧光灯,光照强度为1800 Lx,16 h/天光照。在上述最佳条件下,银香菊丛生芽生根率达到最大。(5)将银香菊再生苗转移至砾石与沙石与珍珠岩体积比为1:1:1(v/v)的无菌基质中进行炼苗,炼苗培养30天后,将温室中生长状态良好的银香菊再生植株转移至田间自然环境生长,2个月后,统计田间生长的银香菊再生苗存活率为100%。(6)通过GC-MS分析方法对银香菊组培再生苗与田间生长植株中挥发性成分进行比较与评估发现银香菊组培再生苗中的单萜和倍半萜成分积累量均高于田间生长的植株。3、激素诱导对银香菊组培再生苗中挥发性成分的影响(1)使用吲哚-3-乙酸(IAA)对银香菊再生苗进行喷施诱导处理考察IAA对银香菊组培再生苗中挥发性成分的影响。实验结果表明通过1 mmol/L的IAA诱导处理,银香菊再生苗中挥发性成分积累增多,其中倍半萜类物质生物合成受到显著影响,长叶蒎烯化合物,经过IAA诱导刺激后含量迅速积累。(2)使用褪黑素对银香菊再生苗进行喷施诱导处理考察褪黑素对银香菊组培再生苗中挥发性成分的影响。实验结果可知,0.5 mmol/L褪黑素诱导处理对银香菊再生苗中挥发性成分含量积累和组成都产生更加显著的影响,其中delta-榄香烯倍半萜化合物经过褪黑素诱导后大量合成积累。4、激素诱导处理银香菊组培再生苗的转录组测序及数据分析(1)本研究利用Illumina测序技术获得了植物激素IAA与褪黑素喷施处理后银香菊组培再生植株的转录组数据,组装后获得转录本共756826条,最小转录本长度为200 bp。(2)通过比对IAA激素处理前后银香菊再生苗转录组数据,共筛选获得22326个差异表达基因,其中上调表达的基因个数为10373个,下调表达的基因个数为11953个。通过GO分类功能分析发现所有差异表达基因主要被分布到细胞组分,分子功能与生物过程;通过KEGG分析共注释到了 3747个差异表达基因于20个显著富集的KEGG Pathway上,此外,银香菊萜类物质合成通路中关键酶基因会受到外源激素的显著诱导与调控,IAA激素诱导后有20个关键酶基因表达量发生变化。(3)通过比对褪黑素处理前后银香菊再生苗转录组数据,共筛选获得24387个差异表达基因,其中上调表达的基因个数为11705个,下调表达的基因个数为12682个。褪黑素处理银香菊再生苗中获得的差异表达基因GO分类功能分析表明差异表达基因主要富集在结合功能、催化活性、细胞生命过程、代谢过程与单细胞形成过程;KEGG代谢通路富集分析共注释到了 3495个差异表达基因,褪黑素诱导后银香菊萜类骨架合成通路中有19个关键酶基因的表达量发生变化。5、激素诱导处理银香菊组培再生苗中挥发性成分生物合成途径关键调控基因的表达验证(1)使用IAA激素诱导处理银香菊再生苗12 h时,除了HMGS基因以外的所有基因相对表达水平均显著提高,其中,乙酰基转移酶、甲羟戊酸激酶和香叶基焦磷酸合成酶基因在IAA激素诱导银香菊再生苗中萜类物质生物合成过程中响应效果显著,分别为空白对照组的50.7倍、41.6倍及60.8倍,表明银香菊再生苗中萜类生物合成酶基因能够显著响应IAA激素的诱导刺激发生转录激活作用。(2)使用褪黑素诱导处理银香菊再生苗6 h时,HMGS1基因、HMGR基因、MK基因、PMVK基因、MVD基因、IDI基因及FDPS基因的相对表达水平达到最大值,分别为空白对照处理组的21.5倍、8.2倍、20.2倍、27.1倍、20.6倍、11.5倍及22.0倍,表明银香菊再生苗中萜类生物合成酶基因能够显著响应褪黑素的诱导刺激发生转录激活作用。本研究建立的优化的生产挥发性成分的银香菊组培再生体系,为未来利用该离体器官培养体系工业化生产挥发性活性成分奠定理论基础。利用诱导子技术增强了银香菊组培再生苗中挥发性成分的积累,通过高通量转录组测序初步明确了银香菊组培再生苗中调控挥发性成分生物合成的一些关键酶基因并对其基因表达进行验证,为利用诱导子技术调控其他植物组织培养体系高效生产次生代谢活性成分以及阐明其生物合成关键调控酶基因提供了重要的理论依据。