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目的:在世界范围内,胃癌死亡率占恶性肿瘤死亡率的第二位。在全世界每年新确诊的胃癌病例中,我国所占比例高达42%,尤其在我国北方胃癌高发区,胃癌年死亡率为77.67/105。近几十年来,胃癌的发生部位发生明显变化,来源于胃远端部位(胃窦)胃癌的发生率明显下降,而食管胃交界部位(esophagogastric junction,EGJ)肿瘤(包括远端食管腺癌和贲门腺癌)的发生率呈明显增高趋势。此变化趋势在西方国家尤为明显,并引起广大学者的关注。1996年Siewert等将位于EGJ区域的腺癌命名为食管胃交界腺癌(Adenocarcinoma of Esophagogastric Junction,AEG),并根据肿瘤中心距Z线距离分为三型,分别为Siewert I型、II型和III型。在我国,由于Siewert I型AEG(食管远端腺癌)发病率很低,大部分AEG为Siewert II型和III型,国内学者笼统称为贲门腺癌(adenocarcinoma of gastric cardia,GCA)。GCA在肿瘤的发生机制、生物学行为等方面不同于非贲门胃癌,为一种独特的胃癌病理学亚型。从病因学上分析,GCA主要与胃食管反流病、肥胖和白色人种有关,而远端胃腺癌(Distal Gastric Adenocarcinoma,DGA)的发生与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染和膳食因素密切相关。目前,已有研究表明Hp感染是DGA发生的重要危险因素,而在GCA发生中的作用却存在很大争议。有学者认为,血清Hp阳性与GCA发病无明显相关,而有些学者持不同的观点,认为Hp感染在一定程度上有保护贲门黏膜作用。EBV(Epstein-Barr virus)是胃癌发生的另一危险因素。研究表明,胃癌患者中约1.3%-20.1%存在EBV感染。而且EBV相关胃癌多见于近端胃以及弥漫型胃癌中。而另一研究持完全相反的观点,认为在肠型胃癌中EBV感染频率更高。目前,有关EBV和胃癌发生风险及发病部位之间关系的研究甚少,仍需进一步研究。研究发现Hp和EBV都与胃癌的发生有关,已有研究表明Hp是DGA的重要危险因素,EBV相关胃癌则多见于近端以及弥漫型胃癌中,那Hp和EBV感染是否在不同位置胃癌存在差异呢?这需要我们进一步研究。研究表明在Hp感染的胃癌组血清中TNF-α的表达显著升高,TNF-α的表达会通过传统途径激活NF-κB通路,相反,TNF-α过表达也会增加胃粘膜组织Hp的易感性,在癌变过程中发挥重要作用。NF-κB是一个重要的核转录因子,在炎症和癌症发展之间起一定的桥梁作用。Hp感染或相关蛋白也可直接刺激上皮细胞NF-κB的表达。同样的,Hp感染也可以引起NF-κB介导的TNF-αm RNA的表达。最近,有研究显示EBV可以通过激活NF-κB途径来诱使免疫抑制蛋白吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的表达使人单核巨噬细胞中TNF-α和IL-6的表达升高。本研究拟采用改良Giemsa、亚甲蓝、Warthin-Starry镀银以及免疫组织化学染色方法观察胃癌组织中Hp感染情况,选用Real-Time PCR技术比较不同部位胃癌患者Hp、EBV检出率。同时,采用免疫组织化学染色检测NF-κB、TNF-α在不同部位胃癌组织中的表达,进一步观察Hp感染对NF-κB、TNF-α表达的影响,进而系统分析Hp、EBV感染在GCA和DGA发生过程中可能存在的差异,为高发区胃癌的防治提供科学的理论依据。方法:1 Hp的传统染色应用改良的Giemsa染色、亚甲蓝染色、Warthin-Starry银染色和苏木素-伊红染色(HE)对GCA和DGA患者组织标本进行Hp传统染色。2免疫组织化学分析选取2011-2014年河北医科大学第二医院手术切除胃癌组织标本共113例,其中GCA 62例,DGA 51例(图1-2)。运用免疫组织化学方法研究NF-κB、TNF-α在GCA与DGA中的表达情况。3 Real-Time PCR技术检测胃癌患者Hp及EBV感染情况切取胃癌组织标本6片,每片8-10微米,采用DNA提取试剂盒提取组织总DNA。应用Go Taq?q PCR试剂盒对组织DNA进行Real-time PCR扩增。反应体系为20ul:10ul Go Taq?q PCR预混液、2ul模板DNA、上下游引物各0.4μL,引物终浓度为0.2μM。CT≤35作为阳性结果的判定标准。应用SPSS21.0软件进行统计分析,并应用?2卡方检验和Fisher确切概率进行分析。P<0.05具有统计学意义。结果:1 Hp在胃癌患者中的感染情况Real-Time PCR检测结果显示,在113例胃癌标本中85例(75.2%)显示Hp感染。Hp感染患者中细胞毒素相关蛋白A(Cytotoxin associated gene A,Cag A),细胞空泡毒素A(vaeuolo-ating Cytotoxin A,Vac A)及Cag A+/Vac A+检出率分别为30.1%、38.9%及21.2%。2比较贲门腺癌与远端胃腺癌患者Hp感染情况GCA与DGA患者中Hp 16s r RNA检出率分别为73.8%(45/61),和76.9%(40/52),两组之间统计学无显著差异(P>0.05)。GCA患者Hp Cag A+检出率为31.1%(19/61),DGA组为28.8%(15/52),二者之间无明显差异(P>0.05)。然而,GCA患者Hp Vac A+检出率却明显高于DGA(49.2%vs 26.9%,P<0.05)。而且,Cag A+/Vac A+在GCA和DGA两组之间也存在显著差异(73.3%vs 45.0%,P<0.05)。3胃癌患者中EBV检出情况Real-Time PCR检测发现,胃癌患者中EBV的检出率为15.6%(15/96)。其中在GCA中的感染率为21.3%(10/47),高于DGA肿瘤组织中的检出率(10.2%),但无统计学意义(P>0.05)。4在GCA和DGA之间Hp和EBV的双重感染进一步分析不同部位胃癌患者Hp、EBV双重感染情况,GCA患者Hp Vac A+且有EBV感染的比率为8.5%(4/47),明显高于DGA组患者的感染率(4.1%,2/49,P<0.05)。5 Hp感染与胃癌临床病理特征的关系在GCA及DGA患者中,≤60岁患者Hp Cag A+菌株感染率明显高于>60岁组(P<0.05)。在DGA患者中,Hp Vac A+菌株感染与淋巴结转移、肿瘤分期密切相关(P<0.05)。而在GCA患者中与两者无显著统计学意义(P>0.05)。进一步分析不同部位胃癌中Hp感染情况,发现有淋巴结转移的GCA病例中Hp Vac A+检出率为47.1%(16/34),而在DGA患者仅为10.0%(3/30),二者具有明显统计学意义(P<0.05)。6 TNF-α和NF-κB在GCA和DGA中的表达4统计分析GCA肿瘤组织中TNF-α的表达明显高于DGA(95.6%vs 57.5%,P<0.05)。与之相似,NF-κB在GCA中阳性表达率为75.0%,高于DGA组织中的表达(48.5%,P<0.05)。在伴有Hp感染的GCA中,TNF-α阳性表达率为95.6%(43/45),在DGA组为57.5%(23/40),两者之间存在显著差异(P<0.05);同样,Hp感染GCA组织中NF-κB蛋白表达明显高于DGA组(75.0%vs 48.5%,P<0.05)。结论:1不同部位胃癌患者Hp感染情况无明显差异,提示Hp感染是GCA和DGA发病的危险因素。2 Hp Cag A+菌株在不同部位胃癌间无显著差异,而GCA患者Vac A+菌株及Cag A+/Vac A+感染率要高于DGA。表明Hp Vac A+菌株为GCA发生的重要危险因素。3 TNF-α和NF-κB在GCA肿瘤组织中的表达较高,Hp阳性GCA组织中TNF-α和NF-κB的表达同样高于DGA,可能提示Hp感染在GCA发生中发挥重要作用。4不同部位胃癌中EBV检出率无明显差异,EBV是胃癌发生的危险因素,但与发病部位无明显相关。