论文部分内容阅读
FHL2 (Four and a Half LIM protein 2)属于FHL蛋白家族的成员,是一种只含有四个半LIM结构域的蛋白质。已有研究表明,FHL2直接或间接参与调控卫星细胞增值与分化相关重要通路(Wnt/β-catenin, TGFβ)的信号转导过程,且该基因在鸡出生后不同阶段的胸肌中表达呈现显著差异,推测FHL2基因可能为调控鸡骨骼肌卫星细胞增殖分化的重要因子。因此,本研究通过对体外培养的原代鸡胸肌卫星细胞进行FHL2 SiRNA的转染处理,观察对转染不同时间点(12h、24h、48h和72h)的肌卫星细胞增增与分化形态,并通过RT-PCR技术检测转染后(12h、24h和48h)相关成肌调节因子以及Wnt/β-catenin、TGFβ、Notch三条重要信号转导通路中关键基因的1mRNA表达,以及采用Western-Blot检测了FHL2、MYH7B以及NUMB蛋白在转染后(24h、48h和72h)的蛋白表达情况。结果表明:(1)细胞形态学变化:转染后12h,三个试验组细胞在形态学上没有明显的差异;24h后,处理组的卫星细胞数量明显少于两个对照组,对照组细胞极少部分出现分化;48h后,两个对照组细胞长满且大量分化,而处理组细胞少量增殖且仅有极少数细胞开始分化;72h后,两个对照组完全分化且出现肌管,而处理组的细胞数量无明显变化,部分细胞开始分化,但无肌管出现。(2)成肌调节因子的mRNA表达:在转染12h和24h后,处理组中FHL2的mRNA表达显著低于两个对照组(P<0.05);转染后12h,处理组中成肌调节因子MyoD和MyoG的mRNA表达量显著低于两个对照组(P<0.05);转染后24h,处理组中MyoG和MYHC的mRNA表达量显著低于两个对照组(P<0.05);三个试验组中MRF4的表达量在转染后的三个时间点均差异不显著(P>0.05)(3) Notch信号通路:转染12h后,处理组中hairyl的1mRNA表达量显著低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05);转染24h后,处理组中Notch2、Hey1以及hairy1的mRNA表达量显著或极显著低于对照组(P<0.05或P<0.01);转染48h后,处理组中NUMB的mRNA表达量极显著低于另两个组(P<0.01);(4)TGFβ信号通路:关键基因ACVR1的mRNA表达量在转染12h时处理组显著低于两个对照组(P<0.05); ACVR2的mRNA表达量则在转染后三个时间点中均为处理组显著低于两个对照组(P<0.05);(5)Wnt/β-catenin信号通路:转染12h后,处理组中β-catenin、Wnt2b以及Wnt4的mRNA表达量显著或极显著低于对照组(P<0.05或P<0.01);转染24h后,处理组中Wnt4和Wnt6的mRNA表达量极显著低于对照组(P<0.01);转染48h后,处理组中GSK3β和Wnt5α的mRNA表达量极显著低于对照组(P<0.01)。(6) Western-Blot检测表明:转染48h后,处理组中FHL2蛋白和MYH7B蛋白的表达量明显低于空白对照组和阴性对照组;在转染72h后,处理组中NUMB蛋白的表达量明显低于两个对照组。综上,转染FHL2 SiRNA后,鸡骨骼肌卫星细胞的增殖和分化均受到明显的抑制,FHL2的表达量降低下调部分成肌因子的表达,Wnt/β-catenin、TGFβ、Notch三条通路的信号转导也受到不同程度的抑制。因此,本研究推测FHL2基因可能通过Wnt/β-catenin、TGFβ、Notch三条通路的信号转导来调控鸡骨骼肌卫星细胞的增殖和分化,从而影响鸡肌肉的生长。