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肿瘤已经成为威胁人类健康的重要疾病之一，有关肿瘤发病机制的研究也长期是人们科研的热点和难点，一些新的肿瘤发病机制的阐明也为人类攻克这一顽疾提供了更多的思路和方法。目前，临床前的抗肿瘤化合物的筛选主要有两个模式:一是基于靶点的筛药模式，即针对已知的抗肿瘤靶点建立筛选模型，在海量的化合物库中筛到先导化合物，经进一步的结构优化，进行后续的体外及体内的抗肿瘤疗效评价;另一种是基于表型的筛药模式，即直接以体外、体内的抗肿瘤效果为指标，从大量化合物中筛选，并经结构优化，找到有良好活性的化合物，反过来再去研究产生良好药效的分子机制，从而有可能发现新的作用靶点，甚至引起肿瘤治疗的某些突破。我们按照第二种模式，以体外肿瘤细胞抗增殖实验为基础，对本所药化胡有洪课题组所送样品进行了大量筛选，得到了两类有突出药理特点的化合物。 新型2，4，5-取代嘧啶类化合物是一类具有广谱抗肿瘤特点的化合物，对不同组织来源的肿瘤细胞的抗肿瘤活性相近，其中代表性的化合物有YHHU0746和YHHU0895。它们对不同组织来源的肿瘤细胞的增殖都有明显的抑制作用，平均IC50分别为157nM和45.9nM，后者与目前在临床上常用的长春瑞滨(IC50均值为20.4nM)、紫杉醇（IC50均值为18.7nM）在同一数量级上。在体内，YHHU0746和YHHU0895同样具有一定的抗肿瘤活性。 由于2，4，5-取代嘧啶类化合物是新结构母核，其抗肿瘤机制不明，为此我们做了一系列工作来探究分子靶点。根据新型2，4，5-取代嘧啶类化合物能显著诱导肿瘤细胞阻滞在G2/M及能破坏细胞骨架的现象，我们推测其有可能作用于骨架蛋白。果然，YHHU0746和YHHU0895均能显著抑制纯化微管聚集体系中微管的聚集以及诱导细胞水平微管的解聚，说明了其作用靶点为微管蛋白。而且，YHHU0746和YHHU0895能剂量依赖性抑制微管蛋白与秋水仙碱的结合，提示了它们主要结合在微管蛋白的秋水仙碱位点上。 多药耐药问题是临床上妨碍化疗的主要问题之一，而常见的化疗药长春瑞滨、紫杉醇都存在这一问题，因此在新开发的抗微管类药物中抗多药耐药是评价的重要指标之一。我们发现，与秋水仙碱、长春瑞滨、紫杉醇等在P-糖蛋白高表达的KBV200以及K562/ADR细胞中的细胞毒性远弱于在亲本细胞KB及K562的作用不同，YHHU0895在KBV200以及K562/ADR细胞的细胞毒性作用与亲本细胞KB及K562相近，而且，它同样能在较低浓度促进P-糖蛋白高表达细胞中微管的解聚，诱导G2/M细胞周期阻滞以及细胞凋亡。更重要的是，在体内，虽然YHHU0895对KB移植瘤的抗肿瘤活性要弱于长春瑞滨，但其对P-糖蛋白高表达的KBV200移植瘤要强于长春瑞滨。这种抗P-糖蛋白介导的多药耐药的优势无疑是YHHU0895抗肿瘤活性的一大亮点。 新型哒嗪酮类化合物是具有特异性抗肿瘤特点的化合物，主要对某些类型的肝组织来源的肿瘤细胞有极强特异性的杀伤作用，而对其它组织来源的肿瘤细胞则作用不明显。代表化合物YHHU0258的选择性可以达到上千倍，而随后结构继续优化的化合物如YHHU0776的选择性甚至达到了万倍以上。更重要的是，体内人裸鼠移植瘤模型上也充分体现了这种高选择性。YHHU0258口服给药可以使敏感细胞株BEL-7402及SMMC-7721移植瘤完全消退，且没有明显的毒副作用，而对于非敏感细胞株HCT116及NCI-H460的裸鼠移植瘤则基本没有作用，这与体外细胞水平的结果是完全一致的。 在探索哒嗪酮类化合物的分子靶点过程中，我们探索了几十种信号通路抑制剂与YHHU0258的联用，没有明显的增效或拮抗效果;激酶及磷酸酯酶活性筛选、细胞周期及细胞迁移等结果也没有提供有价值的线索。后来，我们又尝试了蛋白质组学的策略，找到了一些机制相关的蛋白，如nucleophosmin及parathymosin等癌蛋白，进一步的工作还在进行中。同时，目前我们还在进行亲和层析钓靶点的策略尝试。 通过结构比对，我们发现YHHU0258与已经上市的磷酸二酯酶PDEⅢ及PDEⅣ的抑制剂Zardaverine结构非常相像。根据以下实验结果:首先，PDEⅢ及PDEⅣ在YHHU0258的敏感及不敏感细胞株中的表达量无明显差异;其次，PDE下游的重要信号分子ERK1/2的活性并不受YHHU0258作用的影响;再次，PKA的抑制剂H89，腺苷酸环化酶(AC)的激动剂Forskolin以及总PDE的抑制剂IBMX与YHHU0258的联用均没有体现任何的协同或拮抗效应;最后，Zardaverine具有与YHHU0258相似的体外及体内肝癌细胞株选择性，但PDEⅣ特异性抑制剂Rolipram对YHHU0258敏感细胞株没有细胞毒性作用。由此，我们认为YHHU0258与Zardaverine这两个药物能够发挥特异性抗肿瘤作用，与它们同时抑制PDEⅢ/Ⅳ两个亚型的活性有关。由于PDE具有很强的代偿性，因此如果像Rolipram那样仅仅抑制亚型Ⅳ的活性，那么是不会有太好的抗肿瘤作用的。当然，从逻辑上说，也不能排除YHHU0258另有靶点，从而产生抗肿瘤作用。 综上所述，我们发现了两类具有全新化学结构母核的抗肿瘤化合物，并且构效关系方面的研究十分卓越，最后改造而得的化合物其药理活性均有大幅提高。而同时展开的药理机制研究为这两类化合物的进一步开发奠定了坚实的理论基础。本课题已经申报了多项国际专利，并且已有多篇文章正式发表或在投稿中。