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鸡球虫病是由寄生在鸡肠道上皮细胞内的艾美耳球虫引起的一种寄生性原虫病,多危害15～50日龄的雏鸡,死亡率很高,该病分布广泛,危害极其严重,目前仍以药物防治为主。由于长期不规范地药物使用,导致抗药株的普遍产生。至今已从养鸡场中分离出几乎对所有使用过抗球虫药具有抗药性的虫株,且抗药性产生的时间缩短、程度日趋严重,由单一的抗性变为多重的、交叉的抗性,抗药性已经成为球虫病防治中遇到的最严重的问题,但其产生的机制尚不清楚。对控制某一特定药物抗药性基因的检测,可以监测抗药性的蔓延并增加指导用药策略的有效性。本研究室前期构建了柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株与各自母株之间的抑制性消减文库,利用RACE技术获得了一些与抗药性相关基因的全长序列。本研究选择其中的M20新基因进行了克隆与原核表达,建立了针对M20基因的实时荧光定量PCR方法用于检测柔嫩艾美耳球虫的抗药性,并用鸡体药物敏感试验对定量PCR结果进行了验证。1.球虫抗药性相关基因M20的克隆及表达根据EST序列设计引物,扩增获得了与抗药性相关的新基因M20,其全长cDNA序列为847 bp,包括一个525 bp的开放阅读框,编码174个氨基酸,理论分子量约为19 KDa。其编码的蛋白与刚地弓形虫(Toxoplasma gondii )的胰岛素降解酶在31～477位氨基酸间具有45%的同源性。该基因在未孢子化卵囊阶段的表达量最高,而在裂殖子阶段和子孢子阶段几乎没有表达。将获得的M20全长cDNA连接到原核表达载体pET28b中,成功构建了pET28b-M20的重组表达质粒,并且利用大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达出该重组蛋白,但以包涵体形式存在。Western blot检测,该蛋白还具有一定的免疫原性。2.Real-Time PCR检测柔嫩艾美耳球虫抗药性方法的建立为建立简单、快速的球虫耐药性检测方法,根据M20基因序列设计特异性引物,分别建立了SYBR Green法和TaqMan Probe法的Real-Time PCR方法。结果显示,两种方法均具有良好的特异性和重复性。选择操作简单、成本较低的SYBR Green法对已知具有抗性的地克珠利抗药株、马杜拉霉素抗药株以及对药物敏感的母株之间M20基因表达水平进行了检测,结果显示,敏感株的M20基因表达量明显高于两株抗药株,地克珠利抗药株次之,马杜拉霉素抗药株最少,说明建立的定量PCR用于检测球虫抗药性是可行的。3. Real-Time PCR方法在检测球虫田间株抗药性中应用采用单卵囊分离技术从鸡球虫田间株混合种中进行球虫纯种的分离与鉴定,获得了一株柔嫩艾美耳球虫田间株。以地克珠利抗药株、马杜拉霉素抗药株以及药物敏感株为参照,采用建立的SYBR Green法Real-Time PCR,对所分离的柔嫩艾美耳球虫田间株的M20基因表达量进行了检测。结果显示,柔嫩艾美耳球虫田间株M20基因含量高于敏感株,而敏感株的含量高于地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株,说明所分离的田间株对药物敏感。为了验证定量PCR结果,采用鸡体试验对田间株的药物敏感性进行了研究,结果显示,田间株对马杜拉霉素、癸氧喹酯、地克珠利和盐霉素均表现为敏感,结果与定量PCR的一致。综上所述,本研究对抗药性相关新基因M20进行了克隆及表达;在以地克珠利抗药株、马杜拉霉素抗药株以及药物敏感株作为参照下,建立了以检测M20基因为靶基因的SYBR Green Real-time PCR法,成功应用于球虫抗药性的检测;通过鸡体药物敏感试验验证了Real-time PCR检测方法的正确性。本文所获得M20基因及重组蛋白,为深入探讨球虫抗药性的产生机理奠定了基础。所建立的Real-time PCR检测方法克服了传统球虫抗药性检测方法耗时、耗力等缺点,为今后鸡球虫抗药性检测研究提供了一个新的思路。