论文部分内容阅读
乙型脑炎是由蚊虫传播的人畜共患急性传染病，其病原体是乙型脑炎病毒。该病毒能够引起人类中枢神经系统病变，死亡率高，后遗症严重。我国是乙脑的主要流行区，每年乙脑发病人数达上万例，这些病例主要依靠临床诊断，缺乏可靠的实验室诊断试剂。
本研究旨在建立一种乙脑IgM抗体的快速检测方法，以满足乙型脑炎的临床诊断和疾病预防控制工作的需要。主要研究内容和主要结果如下：
一．乙型脑炎病毒单克隆抗体的建立
1．鉴定乙脑病毒P3株
将实验室保存的乙脑病毒P3株复苏，在C6／36细胞中连续传递三代。病毒感染细胞后出现细胞病变（CPE）；乳鼠颅内接种病毒72小时内全部死亡。病毒不仅能够P3株鼠腹水和抗血清发生反应，还能够与SH-83株、SH-53株、GSS株、A2株制备的鼠腹水发生反应，说明该病毒是乙型脑炎病毒P3株。
2．乙脑单克隆抗体细胞系的建立
使用鉴定的乙脑病毒（P3株）制备鼠脑抗原，免疫8周龄雌性Balb／c小鼠5只，经过4次免疫后JE-1、JE-2、JE-3、JE-5抗体滴度均超过10<4>，其中JE-2、JE-3滴度最高。选择JE-3小鼠，取脾细胞大约5：1与SP2／0细胞混合，使用50％的PEG4000作为融合剂。间接法ELISA筛选出11个阳性融合孔，选择8个OD值较高的融合孔，使用一步法克隆，获得285个单克隆细胞株，最终筛选出13个抗体阳性细胞株。将13个阳性单克隆抗体细胞株连续规律传代9次，有3个细胞株（F12.36、F12.37、E10.21）持续稳定分泌抗体，其它细胞株在不同的传代次数失去抗体分泌活性。制备小鼠腹水，其抗体滴度分别为10<6>、10<6>、10<7>。
3．乙脑单克隆抗体性质鉴定
抗原特异性：利用IFA方法将3株乙脑单克隆抗体分别与6种黄病毒属病毒（JEV、WNV、SLE、DEN、YFV、POW）、3种甲病毒属病毒（EEE、WEE、VEE）和1种布尼亚病毒属病毒（La Corsse）反应，3株单抗只与JEV呈阳性反应，与其它9种虫媒病毒反应皆呈阴性，其中包括与JEV血清学交叉反应最严重的WNV和SLE，说明获得的单克隆抗体是乙脑特异的单克隆抗体。
作用位点：3株单抗之间的AI值均小于50，证明它们的作用位点相同或者非常接近。使用单抗F12.37对全病毒抗原进行蛋白印迹实验，在分子量57kDa附近出现特异性的染色条带，提示单抗的作用位点在E蛋白上。
敏感性和种内反应广谱性：将单抗F12.37与原有和新近分离10株乙脑病毒反应，均能够灵敏检测到产生CPE的10株乙脑病毒，并且具有很好的种内反应广谱性。中和活性：F12.37能够中和基因ш型乙脑病毒（P3株）和基Ⅰ型乙脑病毒（SH03-103株），保护50％细胞不发生病变的稀释度分别为1∶3.2×10〈5〉和1∶10〈5〉。
二．捕获法ELISA检测乙型脑炎IgM抗体方法的建立
工作条件的确定：使用单抗F12.37足量包被鼠源IgG抗体，系列稀释酶标抗鼠IgG抗体，确定OD值等于1条件下稀释度（1∶6000）为酶标抗体的工作浓度。方阵稀释乙脑灭活抗原和乙脑单克隆抗体进行检测，初步获得1∶10稀释抗原，1∶16,000、1∶32,000和1∶64,000稀释单抗反应结果较好。再系列稀释抗人IgM μ链抗体和单克隆抗体，检测后发现5μg／ml，浓度包被抗IgM μ链抗体，单克隆抗体稀释度为1∶16,000时，阳性血清OD值（1.375）最高，而阴性血清的OD值小于0.1，阳性血清和阴性血清的OD值比例大于10。最终确定5μg/mL包被抗μ链抗体，1∶10稀释抗原，1∶16,000稀释单克隆抗体F12.37，1∶6000稀释酶标抗体是最优的反应条件。
特异性评价：为了评价捕获法ELISA的特异性，选择7份ELISA和IFA检测乙脑IgM均为阴性，其它病毒性脑炎IgM抗体检测为阳性的标本，这些标本采集自Cox、Mumps、HHV-6、VZV、CMV等感染的病毒性脑炎病人，使用捕获法ELISA检测后发现，7份标本乙脑IgM抗体都为阴性，说明该方法具有较好的特异性。
敏感性评价：为了评价捕获法ELISA的敏感性，选择了18份不同强度的乙脑IgM抗体阳性标本进行检测。捕获法ELISA对弱阳性标本（OD值≤0.4）检测稀释度可以达到1：800，对中等强度阳性标本（0.4＜OD值≤0.8）检测稀释度最高可以达到1：6400，对强阳性标本（OD值>0.8）检测稀释度最高可以达到1：25,600，这些结果表明该方法的敏感性很高。稳定性评价：为了评价捕获法ELISA的稳定性，选择10份不同强度的阳性标本和4份阴性标本进行重复检测。每份标本先后经过4次检测，检测结果完全一致，并且每份标本检测的OD值变异度均不超过5％，证明该方法具有良好的稳定性。 三．捕获法ELISA检测乙型脑炎IgM抗体方法的评价
为了评价建立的方法，首先比较国内销售的多种试剂盒，然后使用同一批标本对建立的方法进行评价。以2004年和2005年6月～10月间从全国6个省（自治区）采集的212份急性期标本作为检测对象。经过比较，国内销售的K2试剂盒效果优于其它试剂盒，以K2作为评价所建方法的对照。
采用本研究构建的方法和。K2平行检测了212份急性期标本，两者检测的一致率很高（95.28％），x<2 >检验表明两者检测标本的阳性率没有差别（x<2>=4.9＜6.63，P＞0.01）。从212份标本中抽取127标本进行IFA复核，K2试剂盒和本研究方法的检测结果分别与IFA复核结果相比较后发现，本研究方法的特异度（94.12％）明显高于K2试剂盒检测的特异度（82.35％），前者的假阳性率（5.88％）要低于后者的假阳性率（17.65％）。本研究方法和K2试剂盒分别重复检测212份标本后，比较前后两次检测结果发现，两者的可靠性性均较好，但是本实验方法的稳定性（98.58％）略高于K2试剂盒的稳定性（96.23％）。
综上所述，本研究使用灭活乙脑病毒（P3株）制备乙脑特异的单克隆抗体，并进行系统而又全面的鉴定。利用单抗（F12.37）构建了MAC－ELISA方法，并检测212份急性期标本以评价其效果，该方法具有较高的敏感性（92.47％）、特异性（94.12％）、和稳定性（98.58％）。该方法检测效果较好，优于国内现在销售使用的试剂盒（K2）。