论文部分内容阅读
PaaX是苯乙酰辅酶A复合代谢单元(catabolon)的中央调控因子，可调控以paa基因编码为中心途径的不同操纵子的表达。PaaX属GntR家族转录调节蛋白，同时抑制苯乙酸降解相关基因的表达。
本工作将硫磺矿硫化叶菌paaX片段克隆在Novagen pET-28a(+)载体上，在Escherichia coli得到高效表达并通过层析仪得到有效纯化。通过EGS化学交联和分子凝胶过滤层析分析了PaaX的多聚体形式，采用圆二色谱法测定了古菌PaaX的二级结构，应用表面等离子共振技术分析了古菌来源的PaaX与大肠杆菌来源的启动子DNA以及效应物的相互作用关系。
采用悬滴气相扩散法对结晶条件进行了筛选和优化，获得可用于X射线衍射的高质量晶体，并收集了一套分辨率为3.0A的天然蛋白晶体的衍射数据。通过数据分析，该晶体属于P321空间群，晶胞参数为a=b=86.4A，c=105.5A，α=β=90°，γ=120°。此外，还进行了硒代甲硫氨酸衍生物的表达、纯化和结晶工作，获得了较好的硒代蛋白晶体。硒代蛋白的晶体衍射分辨率达到5A，目前进一步的优化正在进行中并尝试通过多波长反常散射法对PaaX的结构进行解析。
本研究结果对于继续深入研究硫磺矿硫化叶菌PaaX的转录调节机制提供了必要的基础数据，对于PaaX蛋白家族的结构及转录调节功能的研究具有重要的意义，对于生物转化，药物中间体的生产以及能量的循环利用也具有重要的意义。
论文的创新性主要体现为：
1)首次从硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus.Solfataricus P2)中克隆得到了与苯乙酸类芳香化合物降解相关转录调节蛋白的全长基因(paaK)，并在E.coli BL21中成功表达和纯化。
2)首次获得一套分辨率为3.0埃的来源于硫磺矿硫化叶菌(S.SolfataricusP2)的PaaX天然蛋白的晶体衍射数据。