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茶汤作为一种古老且广受大众喜爱的健康饮品,具有生津止渴、清凉降火等多种保健功效。先前国内外关于茶汤的研究主要集中在单一化学物质的研究,如茶多酚,而对茶汤这一典型的多相分散体系研究甚少。近年来已有研究表明,茶汤煮泡过程中形成的微纳米颗粒与其生理功效有密切关系,这一研究发现为探索茶汤药用机理开辟了新的探索道路。本课题以正山小种茶叶中蛋白质作为研究对象,考察茶叶由鲜叶到成品茶加工过程中蛋白组分的变化,对水溶性热稳定蛋白进行确定、分离、纯化、表征,讨论在茶汤中存在状态,探索该蛋白形成微纳米颗粒的最适条件、微纳米颗粒形态。主要实验结果如下:(1)通过SDS-PAGE对比茶汤、茶汤超滤截留组分、茶汤超滤滤过组分、新鲜茶叶,确定茶叶中存在水溶性热稳定蛋白,分子量为66.0 kDa和47.0 kDa。通过测定不同单因素条件下得到粗提液的蛋白浓度,得到正山小种鲜叶蛋白提取的优化条件为:适量正山小种鲜叶,料液比(W/V)1:3,加入4℃预冷Tris-盐酸缓冲液(0.05 M,pH 7.2),10%PVPP(g/鲜叶重 g),5M 尿素,1mM PMSF,1mM EDTA,冰浴中研磨,浆液浸提(4℃,3 h),纱布过滤,滤过液离心(4℃,10000 g,30min),上清即为鲜叶蛋白粗提液。(2)对正山小种鲜叶蛋白粗提液、正山小种茶汤、茶汤截留组分应用尿素—UNOsphere Q阴离子交换色谱分离得知,正山小种鲜叶、正山小种茶汤、茶汤超滤截留组分中均存在相对水溶性热稳定蛋白(命名为P66、P47、P18)三条,分子量大小分别约为66.0 kDa、47.0 kDa、18.0 kDa,其中P66和P47具有多酚氧化酶活性,P66达到电泳纯。根据特异性及可行性对P66进行分离、纯化、浓缩。(3)经过SDS-PAGE测定得知P66蛋白分子量为66.0 kDa,高效液相串联多角度光散射结果显示P66蛋白为聚集体,过碘酸-希夫(PAS)染色法鉴定P66为糖蛋白,等电聚焦结果显示P66等电点为4.82,以邻苯二酚为底物研究P66多酚氧化酶酶学特征,结果表明P66的最适温度为35℃,最适pH值为6.2,Cu2+最适浓度为0.25 × 107 M。抑制剂抑制效果为半胱氨酸>EDTA>亚硫酸钠>抗坏血酸。酶动力学参数Km为6.9729 mM,Vmax为15.7878。P66蛋白水溶液透射电镜观察结果表明有自聚集趋势。(4)采用马尔文激光粒度仪对P66蛋白水溶液在30℃下的聚集行为进行探究,结果表明P66形成微纳米颗粒的最适条件为:30℃、pH5.05、恒温30min、蛋白质浓度为0.11mg/mL,粒径多分布在75 nm左右,Zeta电位为-24.7 mV,透射电镜观察该微纳米颗粒表面呈球形结构。