论文部分内容阅读
目的观察双酚A (BPA)对体外大鼠睾丸支持细胞紧密连接occludin蛋白表达的影响,探讨BPA对精子发生的损伤机制。方法原代培养Wistar大鼠睾丸支持细胞(Sertoli细胞)4～5天,双室培养模型的基础上建立体外紧密连接(Tight Junction, TJ)渗透屏障。含有系列浓度(10-3,10-2,10-1,100,101,102,103μmol/L) BPA的无血清培养基(DMEM)孵育Sertoli细胞24h,采用CCK8法检测BPA对Sertoli细胞增殖活性的影响。根据CCK8结果用SPSS17.0软件计算BPA半数致死量(LD50)为150μmol/L,选定梯度浓度的100μmol/L,50μmol/L,25μmol/L BPA作为后续实验组。以0.1%二甲基亚砜(DMSO)为对照组(BPA浓度为0μmol/L),分别以0μmol/L,25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L BPA处理Sertoli细胞24h,细胞免疫荧光染色观察occludin阳性率和表达强度；Western blot半定量检测紧密连接蛋白occludin的表达变化。结果成功分离并培养Wistar大鼠Sertoli细胞,建立了良好的体外TJ屏障模型。CCK8结果显示,不同剂量的BPA染毒24h后,Sertoli细胞的吸光度(OD值)随染毒剂量的增加呈下降趋势。与对照组(0μmol/L BPA)相比,102μmol/L、103μmol/L组的OD值明显降低(P<0.05),10-2μmol/L、10-1μmol/L、100μmol/L和101μmol/L组的OD值确无明显变化(P>0.05)。细胞免疫荧光染色显示,各染毒组均有occludin表达。随着BPA染毒剂量的增加,Occludin荧光表达强度逐渐降低。25μmol/L及50μmol/L组occludin表达阳性率和表达强度均明显降低(P<0.05),未见有强阳性表达；100μmol/L组只有极小部分呈弱阳性表达。Western blot结果显示,Occludin在各剂量组中均有表达,其表达随BPA染毒剂量的增加呈下降趋势。与对照组相比,-25μmol/L、50μmol/L及100μmol/L组的occludin表达明显降低(P<0.05)；与25μmol/L组相比,50μmol/L及100μmol/L组的occludin表达亦明显降低(P<0.05)。结论双酚A可削减Sertoli细胞occludin的正常表达,由此可能损伤紧密连接的渗透性屏障,从而影响正常的精子发生过程。