【摘 要】
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人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）属于β型疱疹病毒,HCMV感染是先天性出生缺陷的主要病毒性病因,也是导致免疫抑制或免疫缺陷的患者产生严重疾病的重要病原。HCMV基因组在人类疱疹病毒中最大,核糖体图谱技术与转录组分析推断其含有515个短的开放阅读框（Small open reading frame,sm ORF）。然而,目前为止尚未完全明确HCMV sm ORF的
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人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）属于β型疱疹病毒,HCMV感染是先天性出生缺陷的主要病毒性病因,也是导致免疫抑制或免疫缺陷的患者产生严重疾病的重要病原。HCMV基因组在人类疱疹病毒中最大,核糖体图谱技术与转录组分析推断其含有515个短的开放阅读框（Small open reading frame,sm ORF）。然而,目前为止尚未完全明确HCMV sm ORF的编码能力及其编码的多肽（sm ORF-encoded polypeptide,SEP）的生物学功能。本研究主要是为了鉴定HCMV中具有编码性的sm ORF,并探究其SEP的功能。在研究中,使用生物信息学分析并筛选出10种具有免疫原性的SEP,并制备其多克隆抗体,验证了其中2种抗体（r ORF73与ORFL297C.i ORF1多肽抗体）的特异性较强。此外,在HCMV感染宿主细胞中检测到病毒能够表达的天然内源性ORFL297C.i ORF1多肽,并通过瞬间转染ORFL297C.i ORF1基因确认其编码能力。我们首次发现ORFL297C.i ORF1多肽具有促进HCMV复制的活性;且ORFL297C.i ORF1多肽分别下调IFN-β和上调TGF-β1的表达,同时也能够抑制TGF-β信号通路的关键蛋白CEACAM1的表达并激活Smad3的磷酸化;说明ORFL297C.i ORF1多肽通过参与调控TGF-β信号通路,发挥抵抗宿主天然免疫应答的作用,从而促进HCMV的生长。本研究提示HCMV sm ORF存在编码多肽的可能性,且其SEP可能具备生物学功能。因此,鉴定具有编码能力的sm ORF有助于进一步了解HCMV,为抗HCMV感染的防治提供新的认识。目前为止,尚未有效的疫苗预防HCMV感染,且不断出现耐药的病毒株;因此,十分有必要开发新的药物和有效的治疗策略。HCMV中的主要衣壳蛋白（Major capsid protein,MCP）在病毒衣壳的形成、成熟以及病毒复制的过程中发挥着关键的作用,提示可将其作为治疗HCMV感染的靶点。外部引导序列（External guide sequences,EGS）是一类短的RNA核酸分子,能够引导t RNA的加工酶核糖体核酸酶P（Ribonuclease P,RNase P）特异性切割其与靶向m RNA互补形成类似于pre-t RNA的复合物;因此,基于RNase P的EGS技术可以作为干扰基因表达的潜在工具。我们课题组先前构建的EGS能够引导RNase P剪切靶向m RNA。在本研究中,以HCMV MCP m RNA为靶点,基于先前构建的EGS,设计与靶向序列互补的EGS变异体核酸分子。在体外剪切试验中,EGS变异体MCP-V625引导RNase P切割靶向m RNA的效率是基于天然pre-t RNA序列设计的EGS MCP-SER剪切效率的80倍。此外,在病毒感染细胞水平上,稳定表达EGS变异体MCP-V625与基于天然pre-t RNA序列设计的EGS MCP-SER细胞的HCMV MCP表达的抑制率分别约为98%和76%,且病毒滴度分别降低10000倍和200倍。进一步研究证实EGS MCP-V625与MCP-SER是通过抑制HCMV MCP的表达,阻碍病毒衣壳成熟与形成的过程,并非能够调控HCMV基因组DNA的复制,从而抑制病毒的生长。本研究证实EGS变异体MCP-V625抑制HCMV基因表达与病毒复制的活性高于基于天然pre-t RNA序列设计的EGS MCP-SER。因此,提示靶向于HCMV MCP m RNA设计的EGS变异体MCP-V625可能是一种治疗HCMV感染引起相关疾病的潜在候选药物。
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