【摘 要】
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脂肪酶（EC 3.1.1.3）是一种重要工业用酶,被广泛应用于食品、医药和化工等领域。来源于海洋放线菌（Streptomyces sp.）的脂肪酶MAS1具有良好的耐热和耐有机溶剂等特性,具有重要的应用前景。为了提升酶的催化性能,本研究聚焦脂肪酶MAS1的催化口袋,选取关键位点分别进行突变,并对突变体进行了表达纯化及酶学性质表征研究,重点研究点突变对MAS1酯化能力的影响。本研究可为重要工业用酶的
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脂肪酶（EC 3.1.1.3）是一种重要工业用酶,被广泛应用于食品、医药和化工等领域。来源于海洋放线菌（Streptomyces sp.）的脂肪酶MAS1具有良好的耐热和耐有机溶剂等特性,具有重要的应用前景。为了提升酶的催化性能,本研究聚焦脂肪酶MAS1的催化口袋,选取关键位点分别进行突变,并对突变体进行了表达纯化及酶学性质表征研究,重点研究点突变对MAS1酯化能力的影响。本研究可为重要工业用酶的理性改造提供良好研究基础。主要研究内容如下:1、基于脂肪酶MAS1结构的突变体设计与制备通过对脂肪酶MAS1的结构分析,醇结合口袋中的G40、T237和V233与酯化反应中水分子浓度有关。将G40、T237和V233分别突变为G40F、G40L、T237A、T237F、T237L和V233F这些疏水性氨基酸,达到减少醇结合口袋水分子的进入,促进酯化反应进行的目的。PCR定点突变获得突变体基因并经过测序验证,将其转入工程表达菌株BL21（DE3）中,在7 L发酵罐中进行诱导表达获得含有目的蛋白的菌体。收集菌体后,利用亲和层析纯化,获得高纯度的MAS1-WT、G40F、G40L、T237A、T237F、T237L和V233F蛋白。2、脂肪酶MAS1突变体的催化特性与基础生化特性表征评价了MAS1野生型及其突变体催化甘油与油酸合成甘油酯的能力。当反应至72 h达到平衡后,MAS1-G40L催化的酯化反应的酯化率达到了76.49%,比野生型提高9.52%,且在产物中,MAS1-G40L催化获得的甘油三酯（TAG）高于野生型。其余突变体中,仅G40F、V233F与T237F的酯化率略微高于野生型,T237A和T237L的酯化率显著低于野生型。在最适反应条件下,以月桂酸和正丙醇制备月桂酸丙酯为反应体系,MAS1-G40L的酯化活力比野生型的酯化活力高1.38倍。进一步对MAS1野生型和突变体进行酶学性质表征,结果表明:MAS1野生型及其突变体催化水解反应的最适温度均为65℃,最适p H值均为7.0。突变体MAS1-G40L在40～70℃的范围展现出比野生型更强的耐热性。在p H 3.0～9.0的范围内,野生型及其突变体的p H耐受性都比较强。Zn2+、Cu2+和Ni2+对MAS1野生型及其突变体酶活力具有抑制作用。除T237F以外其余酶突变体表现出对有机溶剂良好的耐受性。在表面活性剂耐受性方面,SDS对MAS1野生型及其他突变体酶活力都具有抑制作用,吐温80对MAS1野生型及其突变体水解酶活都有促进作用。综上所述,具有最高酯化活力的MAS1-G40L也具有最好的酶学性质。3、BL21（DE3）/p ET22b-MAS1-G40L高密度发酵条件的优化通过单因素实验,在7 L发酵罐中考察了诱导时间、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）浓度、诱导p H和诱导温度对生物量和MAS1-G40L表达量的影响。然后分别以IPTG浓度、诱导p H和诱导温度为变量,通过支持向量机和遗传算法的优化及实验验证,进一步优化了IPTG浓度、诱导p H和诱导温度,最后探究了不同补料方式对重组大肠杆菌产MAS1-G40L的影响,确定最佳发酵条件为:37℃、p H 7条件下发酵7 h时添加终浓度为0.65 m M的IPTG进行诱导、诱导温度为23℃、诱导p H为6.70。采用p H-STAT进行补料,发酵22 h时,MAS1-G40L酶活力最高为4123 U/m L,比优化前提高了2.38倍。
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