论文部分内容阅读
目的:观察不同浓度的淫羊藿苷(ICA)对去卵巢骨质疏松(OP)大鼠的治疗作用,并在此基础上研究ICA对OP大鼠骨组织Wnt/β-Catenin信号通路的影响,以期阐明ICA保护骨量、治疗OP的生物学机制,为开发传统中药治疗绝经后骨质疏松(POP)提供生物学理论依据。 方法: 1.POP模型的制备:运用双侧卵巢切除法复制POP模型。 2.实验分组:将86只SD大鼠随机分为空白组(16只)和模型组(70只)。待造模成功后,根据是否给予ICA,将模型组随机分为模型对照组(OVX组)、阳性对照组(Positive组)、ICA低剂量组(ICA-L组)、ICA中剂量组(ICA-M组)、ICA高剂量组(ICA-H组),每组14只。 3.骨密度(BMD)的检测:分别于造模12w后和药物干预12w后,采用双能X线吸收法(DXA)检测各组大鼠腰椎、股骨的BMD。 4.血清各指标的检测:采用全自动生化分析仪测定血清中血清钙(Ca2+)、磷(P3+)、碱性磷酸酶(ALP)、肌酐(BUM)、尿素(Cr)、谷氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)的含量;运用ELISA法检测血清中骨保护素(OPG)、骨钙素(BGP)的含量。 5.生物力学的检测:采用三点弯曲试验检测股骨的最大弯曲载荷;采用压缩试验检测腰椎的最大压缩载荷。 6.骨组织形态学观察:将大鼠股骨、腰椎放入Micro-CT仪进行扫描,观察骨小梁分离度(Tb.Sp),骨小梁厚度(Tb.Th),骨小梁数量(Tb.N)的变化。 7.股骨的病理学观察:将大鼠股骨进行HE染色,观察各组大鼠股骨的病理学的变化。 8.Wnt/β-Catenin信号通路中β-Catenin蛋白的表达:采用Western-blot法检测大鼠胫骨中β-Catenin蛋白的表达。 9.Wnt/β-Catenin信号通路中Lrp6、GSK-3β、β-Catenin、Runx2 mRNA的表达:采用QPCR检测股骨中β-Catenin、GSK-3β、Lrp6、Runx2 mRNA的表达。 结果: 1.造模复制12w后,OVX组BMD显著性减低(P<0.05),说明造模成功。 2.药物干预12w后,与Sham组比较,OVX组BMD和骨强度降低,血清中Ca2+、P3+含量显著下降,Tb.N和Tb.Th减少(P<0.05),而ALP、BGP含量和Tb.Sp增加(P<0.05);而给以相应的药物后,Positive组、ICA-L组、ICA-M组、ICA-H组BMD、骨强度、Tb.N和Tb.Th和骨矿盐含量均显著上升(P<0.05),同时Tb.Sp降低(P<0.05),其中ICA-M组最为明显,趋于Positive组。 3.Western-blot结果显示,与Sham组比较,OVX组中β-Catenin蛋白含量显著减低(P<0.05);与OVX组比较,ICA-M组中β-Catenin蛋白显著性增加(P<0.05)。 4.QPCR结果显示,与Sham组比较,OVX组中β-Catenin、Lrp6、Runx2 mRNA显著降低(P<0.05),而GSK-3β mRNA显著增加(P<0.05);与OVX组比较,ICA-M组β-Catenin、Lrp6、Runx2 mRNA表达显著增加(P<0.05),而GSK-3βmRNA显著减低(P<0.05)。 结论: 1.大鼠双侧卵巢去除后,其BMD、Tb.N、Tb.Th和骨强度以及骨矿盐含量明显降低,而骨小梁分离度明显增加;用ICA进行干预后,能显著扭转上述症状,即能有效增加4、5腰椎和股骨的BMD,增加骨组织骨小梁数量、骨小梁厚度,增加骨强度和骨矿盐含量,降低骨小梁分离度,说明ICA对去卵巢OP大鼠具有较好的抗OP的功效。 2.其中ICA-M组抗OP的作用尤为明显,因此,我们采用该剂量组的大鼠进行机制学研究。研究发现,ICA抗OP的作用可能是通过上调Wnt/β-Catenin信号通路中Lrp6受体mRNA,增加GSK-3β mRNA的磷酸化从而增加β-Catenin积累,使β-Catenin进入细胞核中,激活的Wnt/β-Catenin信号通路,刺激Wnt/β-Catenin信号通路下游靶基因Runx2 mRNA的表达,促进成骨细胞增殖与分化,抑制破骨细胞吸收,从而达到抗OP的功效,为开发ICA提供动物机制学基础。