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人口的快速增长、工业和城市化进程的加剧使得人类对资源和环境的开发利用强度达到了空前的规模,其造成的环境污染已成为制约人类发展的重要因素,甚至直接威胁到人类的生存和身体健康,因此对污染物的治理和处理是摆在我们面前亟需解决的重大问题。芳香族化合物是一类重要的工业原料,稳定的化学结构和低水溶性使其成为难降解的有机污染物之一。传统的物理、化学方法对该类化合物的处理效果较差,而微生物快速适应它们的存在并进化出多种降解途径,且具有成本低、无二次污染等优点,因此越来越受到人们的关注。相对于真菌和厌氧细菌的非特异性代谢,一些好氧细菌能够利用芳香化合物作为其碳源、氮源或硫源来进行生长和繁殖,这使它们在此类污染物的治理修复方面更具优势。研究表明,芳香族化合物的好氧降解包含两个重要过程—芳环的羟基化及开环裂解反应,它们均由微生物体内的加氧酶催化完成。因此,加氧酶是芳环好氧降解途径中的关键酶系,关系到该类化合物的可降解性和降解程度。目前研究者已经鉴定和表征了很多的芳环加氧酶,但是对它们的分子催化过程的仍缺乏了解,因此深入研究这些酶的催化反应机制,并在此基础上进行酶的工程改造,将是环境保护领域研究热点。芳香化合物4-硝基酚(p-Nitrophenol)是一种应用广泛的化工原料和中间体。接触或者吸入4-硝基酚能够引发眼睛,皮肤或者是呼吸系统炎症,若不慎服用会导致腹痛、呕吐、呼吸困难甚至昏迷等症状。另外硝基酚的硝基基团在环境中会还原产生亚硝基或者羟胺基团,此类中间体是亲电子试剂,很容易与生物大分子发生反应产生毒性,接触它们甚至有致突变或致癌的危险。对苯二酚途径是微生物降解4-硝基酚的主要途径之一,而双加氧酶PnpCD则在该途径中发挥了最为关键的"开环"(Ring-cleavage)作用,因此PnpCD催化机制的研究将为4-硝基酚的生物治理和修复提供重要的分子基础。我们课题的第一部分就是试图通过解析PnpCD蛋白和PnpCD-底物类似物的晶体结构,来阐明PnpCD开环裂解hydroquinone的催化反应机制。通过这部分的实验,我们得到了以下结果:(1)PnpCD蛋白在结构中是以异源四聚体α2β2[(αβ)2]的形式存在,与蛋白在溶液中的聚合状态相符。结构分析表明异源四聚体的两个αβ间主要是依靠疏水作1用来维持的,因此蛋白以异源四聚体的形式存在会有效减少蛋白疏水区暴露于溶剂中的面积,这将有利于蛋白的稳定,从而提高双加氧酶的催化效率。(2)PnpC的整体结构是由两组反平行的β-strands交互折叠而成,它们共同环绕形成了一种卷桶状的结构,属于cupin superfamily。与metal-binding cupins进行序列比对发现,PnpC理论参与metal coordination的氨基酸不保守,这暗示着PnpC不具有结合金属辅因子的能力。通过结构叠合发现PnpC有几个区域与metal-bindingcupins存在着明显的区别,这些区域都位于metal-bindingsite附近,进一步表明PnpC不能结合金属离子。(3)PnpD从整体结构上看可分为两部分,即N端结构域和C端结构域。C端结构域属于cupin superfamily,能够结合金属离子,是催化结构域;N端结构域由4个α-螺旋和8个β-折叠片构成了一种新的蛋白折叠方式。(4)PnpC和PnpD蛋白间存在着大量的相互作用,包括疏水作用和氢键,其相互作用面积占到了 PnpC表面溶剂可及区的30%。一般的cupin蛋白在溶液中均是以二体的形式稳定存在的,在PnpCD复合物中,它更是通过两个亚基间的紧密相互作用将这种结合方式给有效"固化"下来,这将有利于蛋白的稳定和催化效率的提高。(5)最后我们分析了双加氧酶PnpCD催化的几个核心要素,分别是金属辅因子及其配位状态、底物hydroquinone的结合位点和O2可能的结合位点。结构显示PnpD有四个氨基酸参与了金属辅因子配位,这在双加氧酶中并不常见,暗示着其催化机制与其它双加氧酶存在区别。根据上述结构分析我们设计了相应氨基酸的突变体,利用生化试验对这些氨基酸的作用进行了验证,最终在此基础上提出PnpCD可能的催化机制。芳香化合物二苯并噻吩(Dibenzothiophene,DBT)及其衍生物是原油中杂环含硫化合物的主要成分之一,该类化合物的燃烧所释放的SO2会导致酸雨酸雾等严重的环境污染问题。微生物脱硫技术可以选择性地脱除这类化合物中的硫且不损失燃料的热值,具有广阔的应用前景。"4S"途径是微生物脱硫代谢的代表途径,而单加氧酶DszC是在该途径中发挥了十分关键作用,它催化了 DBT降解的起始步骤,因此DszC的结构研究是十分必要的,它可以为后续的酶工程改造提供重要的分子基础。我们课题的第二部分就是试图通过解析DszC的晶体结构,来阐明单加氧酶DszC催化DBT脱硫的机制。通过这部分的实验,我们得到了以下结果:(1)DszC的整体结构包含了三个区域,即N端α-螺旋区(residues 18-126)、C端α-螺旋区(residues236-417)和中间的 β 桶区(residues 127-235),属于 ACAD superfamily。蛋白的C端螺旋在空间上互相靠近,它们是形成四聚体(dimer ofdimers)的主要原因,疏水作用在该区域的互作中发挥了主导作用。(2)通过结构比对发现,DszC活性位点附近的区域与其它与结构类似的蛋白存在明显的区别,这可能与酶的底物特异性紧密相关。(3)我们在DszC residues 280-295的区域(位于α9和αl0之间)观察到了着两种截然不同的构象—分别是dimero中的"开放构象"和dimerC中的"闭合构象"。这段变化很大区域正好位于活性位点的入口处,因此"开/关"构象可能对应了 DszC "未结合配体"和"结合配体"这两种状态。(4)我们首先通过分子对接的方式构建了 DszC(dimerC)-FMN复合体,探讨了中间体C4a-(hydro)peroxyflavin形成和稳定的方式,然后我们还构建了DszC(dimerC)-FMN-DBT复合体,分析了底物DBT以及02与DszC的结合方式。根据上述的分析设计了相应氨基酸的突变体,利用酶活测定对这些氨基酸的作用进行了验证,进而提出了 DszC可能的催化反应的机制。