黑壳子粳抗稻瘟病基因Pi-hkl候选基因的克隆和初步功能验证

• 作 者: 储瑞珍
• 机 构: 南京农业大学
• 出 处: 南京农业大学
• 发表日期: 2013年期
• 关键词: 水稻 稻瘟病菌 抗病基因 Pi-hk1 基因克隆 遗传转化

由子囊菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病是世界性水稻病害之一,严重威胁水稻生产。开展抗稻瘟病新基因的鉴定和功能分析对抗病育种具有重要的现实意义。太湖流域的地方粳稻品种黑壳子粳是一个广谱高抗的水稻品种,对多个稻瘟病菌株表现稳定持久的抗性。前期研究通过日本鉴别菌株北1在11号染色体上定位到主效抗稻瘟病性基因Pi-hkl,进一步定位于RM7654和In5区间内。本研究在Pi-hkl前期精细定位和物理作图的基础上,对候选基因进行克隆、生物信息学分析和表达分析,并通过农杆菌介导的遗传转化方法获得转基因植株,对候选基因进行了初步功能分析,结果如下：1.定位区间内有4个ORF:P13编码含有Myb DNA结合结构域的蛋白,与日本晴序列一致,与感病品种苏御糯存在一个氨基酸的差异；P14是反转座子；P15和P16基因的编码蛋白具有典型NBS-LRR抗病结构；P15蛋白在日本晴和苏御糯中存在多处氨基酸插入与替换,并含有日本晴和苏御糯中都不存在的两个串联的WRKY结构域；P16基因的编码蛋白与日本晴的相似性达到92%。与日本晴中不同,黑壳子粳中P15、P16编码方向相反,两个基因的转录起始位点相距189bp。2.利用实时荧光定量PCR技术,对黑壳子粳和苏御糯在稻瘟病菌接种0、4、8、12、24、48、72h后,3个候选基因表达情况进行分析。结果表明3个候选基因均为组成型表达,并明显受到稻瘟病菌接种诱导。在抗病品种黑壳子粳中,稻瘟病菌胁迫4h后,3个基因的表达即有明显上调,早于感病品种苏御糯中基因的表达。3.扩增3个候选基因的cDNA全长或基因组编码序列全长,构建候选基因的过表达载体；利用覆盖定位区间的BAC质粒,构建了包含P15、P16基因组全长的共转化载体,并进一步构建了P15和P16的功能互补载体；以感病品种苏御糯作为受体进行遗传转化,分别获得了相应的转基因阳性株系。4.对T2代P13过表达转基因阳性株系、T1代P16过表达转基因阳性株系进行稻瘟病菌喷雾接种,结果表明,过表达P13和过表达P16的转基因植株稻瘟病抗性均有所提高；对部分T0代的P15过表达阳性株系、P15和P16共转化的阳性株系进行接菌鉴定,结果表明过表达P15的转基因植株、P15和P16共转化的阳性植株稻瘟病抗性明显增强。