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犬流感是由犬流感病毒（canine influenza virus,CIV）引起的一种水平传播的接触性传染病,受感染的犬会产生呼吸系统病症甚至肺炎,易与其他病原继发感染,严重时造成犬的死亡。H3N2亚型是我国及周边亚洲国家流行的CIV主要亚型,近年来研究表明,CIV也可传染给猫,但是尚没有H3N2亚型CIV感染人的报道。由于犬和猫与人类接触最为密切,为了防止其成为流感病毒重组“混合器”,产生流感病毒新亚型对人类健康造成威胁,制备对H3N2亚型犬流感具有治疗作用的抗体具有十分重要的公共卫生意义。1.H3N2亚型犬流感病毒血凝素单克隆抗体的制备与活性分析将H3N2亚型犬流感病毒A/Canine/Jiangsu/06/2010（JS/10）作为免疫原,皮下多点免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,经最后一次腹腔加强免疫之后,取血清抗体效价大于1:51200的两只小鼠的脾脏与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,采用全病毒间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经有限稀释法亚克隆4次之后,共获得3株稳定分泌抗体的单克隆细胞株,分别命名为10F11、11E3和12E7。其中10F11和11E32株具有血凝抑制活性,对其制备了小鼠腹水抗体,未纯化的腹水抗体ELISA效价分别为1:3200和1:1600,细胞微量中和活性均为1:3200。12E7抗体不具有血凝抑制（HI）活性,细胞上清抗体ELISA效价为1:23。为了验证抗体所针对的蛋白表位,将H3N2的血凝素HA、HA的两个亚基HA1、HA2、离子通道蛋白M2e和核蛋白NP进行原核表达,验证结果显示10F11和11E3 2株单克隆抗体为HA2表位,12E7为M2e表位。中和试验结果表明所得3株抗体均具有一定的抗病毒活性,为制备H3N2犬流感病毒的诊疗制剂奠定基础。2.H3N2亚型犬流感病毒鼠/犬嵌合抗体scFv-Fc的制备与活性分析为减少鼠源单克隆抗体的异源性在犬临床治疗中引起的宿主免疫排斥反应,针对H3N2亚型犬流感病毒（CIV）,制备具有犬源Fc片段的鼠/犬嵌合抗体。从产生具有良好中和活性CIV单抗的鼠源杂交瘤细胞株中扩增抗体重链和轻链可变区,通过重叠延伸PCR（SOE-PCR）获得单链抗体（scFv）片段,同时从犬外周血单核细胞中扩增得到犬源抗体Fc片段;分别构建scFv与嵌合抗体scFv-Fc表达载体,通过大肠杆菌表达、纯化后调整蛋白浓度为1 mg/mL,检测单链抗体与嵌合抗体的ELISA和血凝抑制（HI）效价,并分析其对病毒感染细胞的中和活性。获得的H3N2亚型CIV鼠源scFv的相对分子质量大小为45 kD,ELISA及HI效价分别为1:640（1.56 μg/mL）和1:160（6.25 μg/mL）,中和效价为 1:160（6.25 μg/mL）;鼠/犬嵌合抗体 scFv-Fc 的相对分子质量大小为8 kD,ELISA及HI效价分别为1:2560（0.39 μg/mL）和1:640（1.56μg/mL）,中和效价为1:40（25μg/mL）。成功制备了 H3N2亚型CIV鼠/犬嵌合抗体,为犬流感的临床治疗提供了物质基础。3.H3N2亚型犬流感病毒单克隆抗体及鼠/犬嵌合抗体的免疫保护性分析为研究单克隆抗体11E3和鼠/犬嵌合抗体scFv-Fc在体内对H3N2亚型CIV感染的保护性,以BALB/c小鼠为感染模型,评估单克隆抗体11E3和鼠/犬嵌合抗体scFv-Fc对H3N2亚型CIV感染的保护效果。病毒感染前24h,将单抗和嵌合抗体分别以20 mg/kg的最大保护剂量腹腔注射到小鼠体内,随后将小鼠鼻腔感染107EID50的流感病毒,在病毒感染后第2、4、6、10和14天共5个时间点对小鼠体重、脏器病毒分布、脏器或粪便病毒载量进行监测,检测肺脏细胞因子水平（IFN-γ和TNF-α）并观察脏器组织病理学切片。试验结果表明,单抗11E3和嵌合抗体scFv-Fc均能减轻由CIV感染造成的体重下降,降低组织病毒载量和粪便排毒量。11E3能够持续降低由于病毒感染引起的细胞因子的表达水平,并减轻脏器损伤。scFv-Fc在病毒感染前6天显著降低细胞因子表达水平,但从第10天以后,小鼠肺脏细胞因子水平较病毒组明显上升。研究表明单抗11E3和嵌合抗体scFv-Fc均能在小鼠体内发挥良好的中和作用,减少动物排毒,降低流感的传播几率。研究结果为将单抗或嵌合抗体应用于犬流感的防治奠定基础。综上,本研究将HA2表位的单克隆抗体的scFv基因与犬抗体恒定区Fc片段融合,成功制备了 H3N2亚型CIV的scFv-Fc鼠/犬嵌合抗体,为犬流感的防治提供物质基础。