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牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus）是一种单股正链RNA病毒,属于黄病毒科、瘟病毒属的成员,主要引起牛的呼吸道症状,腹泻,黏膜糜烂,流产或产出先天缺陷的犊牛等症状,还能引起白细胞减少和免疫抑制。Npro蛋白是ORF中编码的第一种蛋白质,在瘟病毒属中高度保守,具有蛋白酶活性,但目前尚不能完全解释其蛋白水解作用及参与调控免疫抑制的机理。据报道BVDV Npro蛋白通过蛋白酶体途径降解IRF3,并且E1泛素激活酶起到了作用;转录因子ELF4可形成二聚体入核激活I型IFN启动子,诱导I型IFN产生,并参与机体的抗病毒先天免疫反应。我们前期研究证明:BVDV非结构蛋白Npro通过蛋白酶体途径降解BoELF4,负调控I型干扰素的表达;但是Npro蛋白降解ELF4蛋白过程中的作用机制尚不完全清楚。由此,本研究探讨了BVDV Npro蛋白通过泛素化途径降解ELF4的分子机制,以及筛选了与Npro蛋白互作的蛋白,为深入了解Npro蛋白的功能、BVDV感染机体后的免疫逃逸机制及建立有效的免疫防控措施提供理论依据。首先,本研究构建了pcDNA3.1-Npro真核表达质粒,PCR扩增目的基因,胶回收后,对目的基因及表达载体进行双酶切鉴定,之后进行连接与转化,并将鉴定正确的重组质粒pcDNA3.1-Npro转染至293T细胞中,通过Western blot验证。结果显示,在23KDa处出现明显的目的条带,与预期大小一致,证明BVDV Npro蛋白真核表达载体构建成功。其次,利用生物信息学软件预测了Npro蛋白与ELF4蛋白的互作及潜在泛素化位点;并利用Co-IP方法验证了两个蛋白的互作关系。结果显示,BVDV Npro蛋白与转录因子ELF4发生共沉淀;BVDV Npro蛋白通过泛素化降解ELF4,并通过K48位多聚泛素化降解ELF4。以上结果表明,BVDV Npro蛋白与转录因子ELF4存在相互作用,并且BVDV Npro蛋白通过K48位多聚泛素化降解ELF4。最后,将pcDNA3.1-Npro真核表达质粒转染至MDBK细胞中,利用Co-IP方法验证,并将其送去做质谱,对鉴定结果进行GO分析。之后,我们从质谱结果中筛选出25种候选蛋白,重点对Hsp70蛋白进行验证。结果,成功构建了pcDNA3.0-Hsp70真核表达质粒;Co-IP结果显示,BVDV Npro蛋白与Hsp70蛋白发生共沉淀;Hsp70蛋白可以降解BoELF4,当加入Npro质粒时,降解ELF4更加明显。以上结果表明,Hsp70蛋白与Npro蛋白存在相互作用,并且二者可能协同降解ELF4。综上所述,本研究证明了BVDV Npro蛋白与ELF4有相互作用,并通过K48位多聚泛素化降解ELF4;BVDV Npro蛋白与Hsp70有相互作用,并且二者均能协同降解ELF4;Hsp70在协同降解ELF4中的作用机制有待于进一步研究。本研究为深入了解BVDV感染机体后的免疫逃逸机制及建立有效的免疫防控措施提供理论依据。