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奶牛乳房炎是奶牛养殖中最常见、危害最为巨大的疾病之一,金黄色葡萄球菌是奶牛乳房炎的主要致病菌之一,其引发的乳房炎具有致病后难以治愈的特点。肠毒素是金黄色葡萄球菌重要的毒力因子,具有超抗原活性,与引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌的致病性密切相关,多项流行病学调查显示,肠毒素seu基因在奶牛乳房炎样本中检出。基于seu基因的流行性,本研究从奶牛源金黄色葡萄球菌中克隆了seu基因、表达并纯化了金黄色葡萄球菌肠毒素U蛋白（SEU）,建立了检测SEU蛋白水平的ELISA方法以及探索了SEU对牛乳腺上皮细胞增殖和细胞炎性因子分泌的影响。主要研究内容如下:（1）克隆了seu基因。本研究分离了奶牛源金黄色葡萄球菌、提取了细菌基因组DNA,设计引物并克隆了金黄色葡萄球菌肠毒素U的特异性基因seu的基因片段并连接至pMD19-T克隆载体,通过生物信息学分析方法,对seu基因及其编码的氨基酸序列进行分析,预测了SEU蛋白的基本理化特性以及蛋白信号肽和跨膜区域。结果表明,成功获得了长度为786 bp的金黄色葡萄球菌seu克隆片段,分析得知SEU蛋白由261个氨基酸组成,相对分子量约为30.53 kDa,分子式为C1365H2095N355O415S13;理论等电点PI为6.66,总平均亲水性为-0.675,属碱性亲水类蛋白质;体外半衰期为大于10 h,不稳定系数为33.97,为结构较稳定的蛋白质。SEU蛋白不存在跨膜区,是一个膜外蛋白,第117个氨基酸为信号肽成分。（2）表达并纯化了SEU蛋白。本研究将seu克隆片段连接至pET-30a（+）载体质粒,然后将该重组载体转化至表达工程菌株后使用IPTG进行诱导表达,并对表达条件进行优化,最后通过镍离子亲和层析法对SEU重组蛋白进行纯化。结果表明,成功构建了重组表达载体pET-30a（+）-seu,BL21（DE3）pLysS菌株为最佳表达菌株,诱导剂IPTG 0.5 mmol/L终浓度、诱导温度25℃、诱导时间4 h为最佳诱导表达条件;SEU重组蛋白以可溶性形式表达,使用含100 mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗脱目的蛋白,所得SEU重组蛋白纯度较高、纯化效果良好。（3）建立了检测SEU蛋白的ELISA方法。本研究利用纯化所得SEU重组蛋白作为包被及检测抗原,通过对ELISA检测程序的优化,建立了一种快速检测SEU蛋白水平的ELISA方法。结果表明,最佳SEU抗原包被浓度及兔多抗血清稀释度分别为2.5μg/mL和1:6000,酶标抗体最佳稀释度和反应时间为1:2000和40 min;磷酸盐缓冲液、37℃包被2 h为最佳包被条件;5%脱脂乳封闭2 h为最佳封闭条件;25℃直接反应为最佳竞争条件。该方法检测限为0.195μg/mL,在0.19516μg/mL浓度范围内线性关系良好,批内及批间变异系数均低于4%,对人工污染的牛奶样品回收率均高于80%,具有良好的稳定性。利用该方法对seu阳性菌株在全脂牛奶及脱脂牛奶中蛋白分泌情况进行监测,得知牛奶菌液中SEU蛋白浓度处于缓慢增高的持续性态势,在036 h内增长较快,直至120 h时全脂牛奶及脱脂牛奶菌液中SEU浓度分别达0.44μg/mL和0.50μg/mL,实现了对牛奶中的SEU进行初步定量。（4）研究了SEU对牛乳腺上皮细胞增殖和细胞炎性因子分泌的影响。本研究通过CCK-8方法和酶联免疫方法检测SEU重组蛋白对牛乳腺上皮细胞增殖活性和IL-6、IL-8和TNF-α分泌的影响。结果表明,在4 h、24 h时各浓度SEU处理组细胞较对照组细胞增殖活性均有所下降,并且随SEU浓度的升高而降低。测定SEU感染牛乳腺上皮细胞后炎性因子分泌变化的结果显示,不同浓度SEU作用于牛乳腺上皮细胞后,细胞上清液中IL-6和TNF-α含量均有所升高,其中,在10μg/mL SEU作用下牛乳腺上皮细胞IL-6分泌量显著上升;但是不同浓度SEU处理组内IL-8含量均无明显变化。综上所述,本研究通过以上实验获得了seu基因,表达并纯化了SEU蛋白,建立了检测牛奶中SEU蛋白水平的ELISA方法,探索了SEU对牛乳腺上皮细胞增殖和炎性因子分泌的影响,为以后深入研究SEU在奶牛乳房炎中的作用及机制提供了基础信息。