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糖尿病肾病是糖尿病的主要并发症之一，也是西方国家终末期肾病(ESRD)的首位病因。已有的研究表明，转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)可刺激肾实质细胞的肥大，并通过增加细胞外基质的合成，减少细胞外基质的降解而导致肾小球系膜区及肾小管．间质细胞外基质的积聚，最后导致肾小球硬化、肾小管．间质纤维化和肾血管硬化，发生肾衰竭。应用抗TGF-β抗体或TGF-β反义寡核苷酸治疗可显著减少细胞外基质的积聚，减轻肾脏纤维化。有足够的证据提示TGF-β在糖尿病肾病的发生发展过程中发挥关键作用。
目的：探讨链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)诱导的大鼠糖尿病肾病模型肾组织中Smad信号蛋白的活化状态。方法：1、动物分组和模型建立：雄性SD大鼠48只，体重200-250g，分别于成模后4、6、8、10、12、14、16周杀检6只。另设正常对照组6只。雄性SD大鼠禁食16h后腹腔注射STZ(60mg／kg体重)，并于开始注射STZ后72h后取大鼠尾静脉血测血糖，凡血糖≥16.7mmol／L确定为糖尿病大鼠模型制作成功。对照组腹腔注射等体积的枸橼酸缓冲液。2、检测指标：观察大鼠一般情况，测体重、肾重、血糖、血压、尿白蛋白排泄率、血肌酐，24小时尿量；留取大鼠肾组织做PAS及Masson染色；用RT-PCR检测大鼠肾组织TGF-β 1、Smad2、Smad3、α-SMA、E-cadherin mRNA水平;免疫组织化学检测大鼠肾组织中p-Smad2／3、α-SMA和E-cadherin的表达；Western-blot检测大鼠肾组织α-SMA和E-cadherin的蛋白表达水平。结果：1、大鼠糖尿病肾病模型的建立。腹腔注射STZ后，糖尿病大鼠出现明显的多食、多饮、多尿和体重下降等糖尿病症状，血糖明显升高，肾小球体积增大，肾重／体重比值增加，肾小球基底膜增厚，系膜基质明显增宽，尿白蛋白排泄率明显增加，血肌酐水平增高，表明大鼠糖尿病肾病模型已成功建立。2、大鼠糖尿病肾病肾内TGF β／Smad信号蛋白的活化状态。与对照组大鼠相比，糖尿病大鼠肾脏组织内TGF-β 1、Smad2和Smad3 mRNA水平显著增高。正常大鼠肾小管上皮细胞有p-Smad2／3的基础表达，随着糖尿病病情的进展，p-Smad2／3在糖尿病形成后6周显著增高，高峰出现在8周和16周。3、大鼠糖尿病肾病肾小管上皮细胞转分化。
第二节 两种糖尿病动物模型肾组织中Smad蛋白活化状态的对比研究
目的：对比两种糖尿病肾病动物模型肾组织中Smad蛋白活化状态。方法：
1、动物分组：将40只雄性SD大鼠(160-210g)随机分成4组，A组：正常对照组(Con组,n=8)，注射枸橼酸缓冲液；B组：单肾切除组(Nx组，n=8)，大鼠接受右侧肾切除术，2周后腹腔注射枸橼酸缓冲液；C组：糖尿病肾病组(DM组，n=12)，单剂量腹腔注射STZ(60 mg／kg体重)：D组：单肾切除+糖尿病组(DMNx组，n=12)，大鼠接受右侧肾切除术，2周后单剂量腹腔注射STZ(50mg／kg体重)。观察16周后收集标本。2、检测指标：观察大鼠一般情况，各组大鼠测体重、肾重、血糖、血压、尿白蛋白排泄率、血肌酐，24小时尿量；留取各组大鼠肾组织做PAS及Masson染色；用RT-PCR检测各组大鼠肾组织TGF-β<,1>、Smad2、Smad3、α-SMA、E-cadherin mRNA水平；免疫组织化学检测各组大鼠肾组织中p-Smad2／3、α-SMA和E-cadhefin的表达；Western-blot检测各组大鼠肾组织α-SMA和E-cadherin的蛋白表达水平。结果：1、两种糖尿病肾病动物模型一般情况的比较。与DM组相比较，DMNx组大鼠肾重／体重比值增加，系膜基质明显增多，尿白蛋白排泄率明显增加。DMNx组大鼠肾小管间质出现局灶性纤维化。但两组之间的血压，血肌酐水平差异无显著性。2、两种糖尿病动物模型肾组织中Smad蛋白活化状态的比较。与Con组及Nx组相比较，DM组与DMNx组大鼠肾脏组织中。TGF-β<,1>、Smad2和Smad3 mRNA的表达水平均显著增高，且DMNx组较DM组升高更明显。与Con组及Nx组相比较，DM组与。DMNx组大鼠肾小管上皮细胞p-Smad2／3的蛋白表达水平显著增高，且DMNx组较DM组升高更明显。3、两种糖尿病动物模型肾小管上皮细胞转分化的比较。与Con组及Nx组相比较，DM组与DMNx组大鼠肾脏组织中α-SMAmRNA的表达水平均显著增高，且DMNx组较DM组升高更明显；而E-cadherin mRNA的表达水平显著降低，且DMNx组较DM组降低更明显。免疫组织化学及Westernblot结果表明，与Con组及Nx组相比较，DM组与DMNx组大鼠肾小管上皮细胞α-SMA的蛋白表达水平显著增高，且DMNx组较DM组升高更明显；而E-cadherin的蛋白表达水平显著降低，且DMNx组较DM组降低更明显。结论：单肾切除后STZ诱导的糖尿病肾病模型与单纯STZ诱导的糖尿病肾病模型均存在Smad信号蛋白的活化及肾小管上皮细胞转分化，且前者的活化程度及转分化程度均强于后者。
第二章TGF-β<,1>和高糖对肾小管上皮细胞Smad信号蛋白的影响
第一节TGF-β<,1>对近端肾小管上皮细胞Smad信号蛋白的影响
目的：探讨TGF-β<,1>对近端肾小管上皮细胞Smad信号蛋白的影响。方法：1、细胞培养：待生长状况良好的NRK52E细胞60-80％贴壁后，无血清培养基同步24小时，然后给予不同浓度和时间TGF-β<,1>刺激。2、指标检测：采用免疫细胞化学方法检测0、2、4、8、10ng／ml的TGF-β<,1>浓度刺激30分钟，以及TGF-β<,1>(10ng／ml)刺激0、15min、30min、lh、3h后p-Smad2／3核转位情况；RT-PCR检测0h、6h、12h、24h、48h、72h，120不同时间点Smad2、Smad3、α-SMA、E-cadherin和Collagen I mRNA的表达；Western blot方法检测Oh、24h、48h、72h不同时间点α-SMA、E-cadherin蛋白的表达水平。结果：与刺激前比较，TGF-β<,1>以时间和剂量依赖方式上调NRK52E细胞p-Smad2／3核转位，高峰发生在30min(73.1％VS 15.8％阳性细胞百分数)；与刺激前比较TGF-β<,1>以时间依赖方式上调Smad2、Smad3、Smad7和Collagen I mRNA的表达，上调α-SMA mRNA和蛋白的表达，下调E-Cadherin mRNA和蛋白的表达。结论：TGF-β<,1>能活化近端肾小管上皮细胞Smad信号蛋白，并促进肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质的生成。
第二节 高糖对近端肾小管上皮细胞Smad信号蛋白的影响
目的：探讨高糖对近端肾小管上皮细胞Smad信号蛋白的影响。方法：1、细胞培养：待生长状况良好的NRK52E细胞60-80％贴壁后，无血清培养基同步24小时，然后分高糖组(35mmol／L)和甘露醇对照组(35mmol／L)。2、指标检测：采用细胞免疫化学方法检测5.5、15、25、35、45mmol／L不同葡萄糖浓度刺激24h，以及高糖刺激0、15min、30min、lh、3h、6h、12h、24h、48h后p-Smad2／3核转位情况；RT-PCR检测Oh、12h、24h、48h、72h不同时间点Smad2、Smad3、Smad7、TGF-β<,1>、α-SMA、E-cadherin和Collagen I mRNA的表达。结果：与刺激前和甘露醇对照组比较，高糖明显上调NRK52E细胞p-Smad2／3核转位，高峰在24小时；上调Smad2、Smad3、Smad7、TGF-β<,1>、α-SMA和CollagenI mRNA的表达；下调E-Cadherin mRNA的表达。结论：高糖能活化近端肾小管上皮细胞Smad信号蛋白，并促进肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质的生成。
第三章Smad7对高糖介导肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质合成的影响
目的：探讨Smad7对高糖介导肾小管上皮细胞转分化的影响。方法：1、强力霉素(Dox)调控Smad7表达NRK52E细胞株的构建：应用lipofect 2000将含有小鼠全长Smad7 cDNA的Tet-on质粒系统先后转染至正常大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E)，G418培养基和含有潮霉素的培养基两轮筛选后，最后通过鉴定选择Smad7表达受Dox调控的克隆，扩增后冻存备用。2、细胞培养：待生长状况良好的转染Smad7的NRK52E细胞株60％-80％细胞贴壁后，无血清培养基同步24小时，然后分为Dox诱导组和对照组，前者给予Dox(2ug／m1)诱导24h后，给予高糖刺激，后者不加Dox诱导。3、指标检测：采用免疫细胞化学方法检测高糖刺激0、24h后p-Smad2／3核转位情况；RT-PCR检测Oh、12h、24h、48h、72h不同时间点Smad2、Smad3、Smad7、TGF-β1、α-SMA、E-cadherin和Collagen ImRNA的表达；Western blot方法检测Oh、48h、72h不同时间点α-SMA、E-cadherin和Collagen I蛋白的表达水平。