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在目前广泛应用的抗生素类药物中，β-内酰胺类抗生素具有举足轻重的作用。合成或半合成的β-内酰胺抗生素具有天然抗生素不可比拟的优点，因而成为β-内酰胺抗生素的主力军。青霉素酰化酶(penicillinacylase，PA)可以水解青霉素G(penicillinG，PenG)或青霉素V(penicillinV，PenV)获得β-内酰胺抗生素工业中的重要中间体6-氨基青霉烷酸(6-amino-penicillanicacid，6APA)，同时又可以该化合物为原料合成其他多种合成或半合成β-内酰胺类抗生素。因此，青霉素酰化酶是β-内酰胺类抗生素工业中一种具有重要意义的生物催化剂。本研究以来自粪生产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)的青霉素G酰化酶(penicillinGacylase，PGA)为研究对象，以生物信息学为指导，利用基因功能的手段对酶进行理性化设计和改造，以期获得性能改善的生物催化剂。
为了获得本实验所需的来自A.faecalis的PGA基因，本研究先通过聚合酶链反应(PCR)方法从A.faecalis基因组中扩增PGA的结构基因，并构建重组表达质粒载体，测序结果表明该结构基因的开放阅读框为2451bp，编码816个氨基酸残基。在对A.faecalisPGA基因进行核酸序列测定后，采用生物信息学手段对其进行分析。由于蛋白质数据库中与PGA相关的记录已有近200条，因此，也利用同样的方法对数据库中的相关基因进行了分析。
热稳定性是酶的一个重要参数，对工业应用的酶类来说更是如此，因为具有高热稳定性的酶类可以在需要采用较高操作温度以强化反应速率、增加反应物溶解性和降低微生物污染的环境中使用。因此，第三章主要讨论在生物信息学指导下，理性化设计的定点突变对酶的热稳定性的影响。首先利用同源建模方法构建来自A.faecalis的PGA的立体结构模型，随后利用生物信息学软件对该结构模型进行扫描，以寻求假如被同时突变为半胱氨酸残基后可能形成二硫键的候选位点对。根据这些候选位点对的立体化学参数，确定进行突变的位点，同时考虑这些位点在结构模型中的位置、在所有已知的PGA基因中的保守性(以多序列比对为基础)以及突变前后氨基酸性质的相似性等。此外，利用序列变异性分析软件对候选位点的变异性(以位点熵为基础)作系统的分析，选取不保守位点。最终选取的两对位点分别是3-751和52-64。在选择半胱氨酸的密码子时，将Escherichiacoli的密码子偏爱性加以考虑，以消除表达时可能存在的由于密码子偏爱不同导致的困难，选定的半胱氨酸密码子为GCA。采用大引物诱变的方法进行突变体基因构建，并在E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达。考察双突变体以及对应的单突变体的热稳定性参数：最适催化温度，热致死作用和半衰期。结果表明，在3-751位点对的双突变可导致突变体酶最适催化温度提高3℃，在野生型酶的最适催化温度(50℃)下，突变体酶的半衰期较野生型增加了35％；在55℃时，突变体酶的半衰期比野生型的高41％。比较携带一个和两个突变的突变体的热稳定性的变化，可以推测，同时发生的两个突变对突变体的热稳定性的改善存在协同关系。
当宿主菌表达外源蛋白时，其常处于表达蛋白过载的不利生理状态。分子伴侣或某些异构酶可以改善这种不利生理状态下初生肽的折叠，进而提高表达产物的活性或是增强其可溶性。蛋白质异天冬氨酸甲基转移酶(proteinisoaspartatemethyltransferase，PIMT，该蛋白在E.coli中的编码基因为pcm基因)是一种能够将新生肽链中存在的异天冬氨酸残基转化为天冬氨酸残基的异构酶。在本论文的第四章，主要考察了共表达的PIMT对PGA的影响。分别将pcm和PGA基因构建在pET28a(+)和pET43.1a(+)质粒上，组成双质粒表达系统，在E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达。实验结果表明，该两种质粒可以稳定共处于同一个细胞之中，在诱导下能够实现很好的表达。而且，含有双质粒(pcm基因和PGA基因)重组菌株的发酵液上清中PGA酶活力较只含有单个质粒(PGA基因)的酶活力提高了60％；细胞破碎后上清液中PGA活力则提高了80％。这说明，共表达产生的PIMT蛋白不但能够提高PGA活性，而且还能促进其跨越细胞壁进入培养基中。
本研究针对热稳定性对PGA进行改造，是生物信息学辅助蛋白质工程研究的一次尝试。该研究中的思路和方法对于其他类似研究具有一定的借鉴作用。此外，利用共表达来自E.coli的异构酶，提高外源蛋白表达时的折叠效率，为蛋白质类生物技术产品制备中由于折叠而引起的问题提供了一种具有前景的备选解决方案。