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黄花蒿(Artemisia annua L)属于菊科蒿属的草本植物,它的提取物之一青蒿素是一种高效低毒的抗疟药。疟疾作为世界上流行最广、危害最大的寄生虫病,每年约造成150-270万人的死亡,在非洲等地造成了极大的危害。通过干扰疟原虫滋养体的功能、杀灭红细胞内期裂殖体和滋养体,青蒿素系列衍生药物已被世界卫生组织认定为治疗抗药性恶性疟的最有效的药物。为了促进对黄花蒿的进一步研究,理解青蒿素含量与物种遗传变异之间的关系,需要人们对黄花蒿的遗传结构有更深一步的认知。而微卫星标记以其所具备的多项优点,成为了研究该物种的遗传多样性、遗传结构、基因流等的重要工具。
本文利用黄花蒿富集文库对SSR位点进行开发,采用了高效的SSR筛选分离策略:对黄花蒿基因组DNA进行酶切与选择性扩增,之后用5端生物素标记的(AC)15为探针与之杂交,利用磁珠表面的链亲和素与杂交后片段相结合,再通过系列洗涤除去非目标片段,洗脱目标片段再通过PCR进行扩增,将产物连接到T载体上并转化入感受态细胞中,从而得到黄花蒿的微卫星富集文库。
在此之后,同时使用M13F/R、M13F—(AC)10、M13R—(AC)10三对引物通过PCR检测对阳性克隆进行筛选,筛选后测序得到65条可分析序列。统计后发现,含perfect型(AC)n的重复序列共有41条,其中有部分含相隔较远的两条或两条以上重复序列;含imperfect型(AC)n的序列共有19条;含有compound型(AC)n序列的共有5条,分别为(AG)(TG)(AG)1条、(GT)(AT)2条、(AC)(TC)(TA)1条、(TC)(AT)(AC)1条。除了(AC)n SSR之外,在这65条序列当中还出现了perfect型(AG)n以及imperfect型(AG)n重复序列共12次,此外,还有(AG)(AT)型compound序列5次。除了二核苷酸重复之外,三核苷酸重复(TTG)n与(TCC)n也各出现一次。
以基序重复数目为10作为底限,对SSR位点的侧翼序列进行分析,共得到32条非同源性的适宜设计引物的序列,利用软件Primer Primier5.0设计得到32对引物。使用来自广西群体的30个个体与河北群体的24个个体对所设计的32对引物进行多态性检测,共得到8对在合适的反应体系中可以扩增出目的条带,并表现出多态性的引物,比例为25%。
实验首次利用磁珠富集法,构建得到黄花蒿的微卫星富集文库,对黄花蒿基因组中的微卫星序列进行了有效的筛选分离,获得了多态性SSR标记,为进一步从黄花蒿基因组中分离得到大量的多态性微卫星标记提供了可靠的试验方法,为对黄花蒿的遗传多样性,遗传结构等进行分析奠定了基础。文章中还探讨了在物种EST得到大量快速开发的现在,EST—SSR在菊科内部物种中的开发现状和跨属、种通用性,探讨了在黄花蒿上应用该科内其他物种EST—SSR的可能性。