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背景结缔组织病(CTD)相关肺动脉高压(PAH)是目前风湿免疫科医师面临的一大难题,其临床表现隐匿,早期诊断困难,治疗效果不佳,是导致CTD患者死亡的重要原因之一。近年来一些研究发现,抗内皮细胞抗体(AECA)与CTD相关的PAH有较为密切的关系,用细胞酶联免疫吸附法(ELISA)研究系统性硬化症(SSc)、混合性结缔组织病(MCTD)及系统性红斑狼疮(SLE)患者,发现合并PAH组AECA阳性率明显高于无PAH组,已有研究应用免疫印迹法发现SSc患者AECA-75KD条带出现的频率较高,但由于AECA识别的抗原是分子量范围广泛的一组蛋白质,在探讨其致病机制方面存在很大困难。而将蛋白质组学的分离方法及鉴定技术应用于对自身抗原的研究,有助于揭示抗原本质,探讨其发病机制。本研究首次在国内用免疫印迹法检测结缔组织病相关肺动脉高压患者中AECA的阳性率,将重点放在AECA在分子量70KD～80KD的靶抗原上;并结合基质辅助激光解析离子化—飞行时间质谱分析(MALDI-TOF MS),分离和鉴定具有相对特异性抗体的靶抗原,以期探讨其在CTD相关PAH中的作用。目的1.用细胞ELIsA法和免疫印迹法研究AECA在CTD相关PAH中的阳性率,并分析其临床意义;2.基质辅助激光解析离子化—飞行时间质谱分析(MALDI-TOF),分离和鉴定具有相对特异性的抗体靶抗原;3.用相应单抗介导人肺微血管内皮细胞损伤模型,研究其对肺微血管内皮细胞损伤的可能机制;4.对分离和鉴定的AECA相关抗原进行基因重组和表达,检测其相关抗体在CTD患者血清中的阳性率,探讨其临床应用价值。方法1.详细记录实验组和对照组患者有关临床资料,应用细胞ELISA、免疫印迹法检测血清AECA,分析AECA与CTD相关PAH的关系和临床意义:1)固定的EA.hy926细胞为抗原,细胞ELISA方法检测实验组及对照组患者血清AECA。实验组为68例CTD相关PAH患者(只合并PAH而无肺间质、肾脏、神经系统等内脏受累的患者),对照组为12例特发性肺动脉高压(IPAH)患者、61例CTD无PAH的患者(包括CTD单纯合并肾小球病变患者21例、单纯合并间质性肺炎患者20例、无内脏受累患者20例)、20例慢性阻塞性肺疾病(COPD)合并PAH患者及20名正常人。分析上述各组AECA与临床指标的相关性。2)取EA.hy926内皮细胞株的膜蛋白质,免疫印迹法检测以上各组患者血清中AECA,查找相对特异性的条带,并计算各组阳性率,分析其结果与临床指标的关系,探讨此特异性抗体的临床应用价值。2.分离和鉴定与CTD相关PAH有相对特异性的AECA靶抗原。1)根据EA.hy926细胞株免疫印迹法所测得CTD相关PAH患者高频率出现的抗体条带,找到相应蛋白质胶条带,采用MALDI-TOF MS分析,鉴定该抗体所对应的抗原。2)提取人肺微血管内皮细胞(HPMEC)的胞膜蛋白,与EA.hy926内皮细胞株的膜蛋白质分别行双向电泳,进行胶图比对,对差异点进行质谱分析;3)以HPMEC胞膜蛋白为底物,阳性血清查找特异性AECA所对应的抗原,质谱分析鉴定CTD相关PAH的特异性AECA所对应的靶抗原。3.应用抗原的单抗作用于HPMEC,诱导细胞凋亡,从形态和功能方面探讨特异性AECA抗体是否对HPMEC有损伤作用及其可能机制。4构建特异性抗原cDNA质粒和载体,设计合成引物,PCR扩增,双酶切后与表达载体重组,在大肠杆菌中表达,将所得蛋白纯化并行质谱鉴定。用质谱鉴定后的重组蛋白为抗原,用免疫印迹法检测上述各组患者的抗重组蛋白抗体。结果1.以EA.hy926内皮细胞株为底物,细胞ELISA检测结果:CTD患者AECA阳性率(77.52%)明显高于非CTD患者(0.06%)(P＜0.01%),但在CTD各组之间无显著差异,阳性率分别为:CTD相关PAH组76.4%(52/68),CTD合并肾小球受累组81.0%(17/21),CTD合并肺间质病变组85.0%(17/20),结缔组织病无内脏受累组70.0%(14/20)。2.提取EA.hy926细胞株膜蛋白质为抗原,以患者血清IgG为一抗,免疫印迹法结果显示:AECA-78KD条带的阳性率在CTD相关PAH和CTD合并肾小球病变的患者明显高于IPAH患者、CTD无内脏受累患者、CTD单纯合并肺间质纤维化患者和正常对照组(P＜0.05或P＜0.01),分别为:CTD相关PAH患者为79.4%(54/68),CTD合并肾小球病变的患者71.4%(15/21),IPAH患者8.3%(1/12)、CTD无内脏受累患者50.0%(10/20)、CTD单纯合并肺间质病变患者15.0%(3/20)。3.与临床表现的相关性分析显示:CTD有雷诺现象的患者AECA-78KD的阳性率明显高于没有雷诺现象的患者,CTD病程大于五年的患者AECA-78KD的阳性率明显高于病程小于五年的患者,CTD合并重度PAH的患者AECA-78KD的阳性率明显高于轻中度患者。与患者的炎性指标及抗U1RNP、抗SSA抗体之间无明显相关性。3.以EA.hy926细胞株胞膜成分为底物和以HPMEC胞膜成分为底物经蛋白质组学方法分离鉴定所得AECA-78KD的靶抗原成分均证实为膜突蛋白。4.HPMEC有膜突蛋白表达,在炎性因子作用下,HPMEC细胞外可检测到膜突蛋白,膜突蛋白单抗可以对HPMEC造成损伤,主要表现为对数生长期的细胞出现骨架蛋白结构改变和早期凋亡。5.克隆膜突蛋白基因cDNA,将重组的膜突蛋白在大肠杆菌中进行原核表达和纯化。质谱鉴定重组蛋白为膜突蛋白,Western Blot鉴定重组蛋白可以和膜突蛋白单抗结合。6.以重组膜突蛋白作为抗原,免疫印迹法检测上述各组患者血清抗重组膜突蛋白抗体阳性率,分别为:CTD相关PAH患者为44.1%(30/68),CTD合并肾小球病变的患者66.7%(14/21),IPAH患者8.3%(1/12)、CTD无内脏受累患者20.0%(4/20)、CTD单纯合并肺间质纤维化患者15.0%(3/20)。AECA-78KD阳性率与抗重组膜突蛋白抗体阳性率相关性差。与超声心动图的诊断结果比较,抗重组膜突蛋白抗体预测CTD患者出现PAH的灵敏度为44.1%,特异性为65.6%,阳性预测值为58.8%,阴性预测值为51.3%,符合率为69.8%。结论1.细胞ELISA检测CTD患者AECA的阳性率高于非CTD患者;2.CTD不同靶器官受累的患者AECA-78KD条带的阳性率不同,合并PAH和肾小球病变的患者明显高于合并肺间质病变和无内脏受累的患者;AECA-78KD的阳性率与雷诺现象、CTD病程和PAH的严重程度有相关性。3.CTD合并PAH患者和CTD合并肾小球病变的患者可能存在共同的靶抗原(78KD内皮细胞蛋白质),其成分为膜突蛋白;4.人肺微血管内皮细胞有膜突蛋白表达,抗膜突蛋白抗体可能通过诱导肺微血管内皮细胞早期凋亡和改变细胞骨架结构而引起细胞损伤。5.膜突蛋白是AECA识别的自身抗原之一,CTD合并PAH患者和CTD合并肾小球病变的患者抗重组膜突蛋白抗体阳性率明显高于合并肺间质纤维化患者、无内脏受累的患者以及IPAH患者。但抗重组膜突蛋白抗体对于CTD相关PAH的预测价值有限。