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真核生物中，包含至少60个DExD/H解旋酶家族成员。解旋酶是催化双链核酸解旋的酶类。解旋酶还参与DNA修复以及核糖体生成、转录调控等RNA代谢的各个方面。近年来，发现越来越多的RNA解旋酶家族分子能识别RNA或RNA病毒而被看作为重要的识别器。这个家族起初以参与RNA的代谢过程而得名。但后来研究发现DHX9，DHX36以及DDX41等分子能识别DNA结构或DNA病毒。然而，按照习惯，依旧延续使用RNA解旋酶的命名。dsRNA广泛存在于自然界，许多ssRNA病毒在复制过程中也产生双链结构。病毒RNA作为外来抗原被宿主识别并且能激发宿主固有免疫反应。另一方面解旋酶家族中的部分分子作为宿主固有免疫系统的第一道防线，通过不同接头蛋白介导的信号通路转导，能及时、有效地识别外来病毒的侵犯，诱导一型干扰素及促炎细胞因子的产生，引发抗感染免疫反应。本文，我们将着重探讨小鼠mDC抗病毒的免疫机制。我们运用siRNA对解旋酶家族中60个成员分子进行基因沉默，筛选出解旋酶分子DHX33。无论用长polyI:C还是短polyI:C刺激D2SC，其产生IFN-β的量较对照组均明显下降。预示DHX33在mDC中是识别dsRNA及RNA病毒的一个重要识别器。为此，我们展开针对DHX33在D2SC mDC中识别dsRNA及RNA病毒的机制研究。1. DHX33在D2SC中识别dsRNA及RNA病毒的免疫功能研究我们运用慢病毒感染技术，建立DHX33shRNA的稳定表达的D2SC mDC细胞系。scrambled shRNA基因沉默对照的D2SC作为阴性对照，IPS-I基因沉默的D2SC作为阳性对照。分别用长或短polyI:C刺激细胞，通过ELISA方法检测细胞上清产生一型干扰素水平（IFN-α和IFN-β）。在DDX33基因沉默的D2SC中,上述刺激物产生一型干扰素的量较对照组比较均明显下降。这一结果显示，DHX33在识别长或短polyI:C中都起到了重要作用。接下来我们要研究DHX33在D2SC mDC中是否识别病毒感染。我们收集reovirus或LPS感染的阴性、阳性对照组细胞以及DHX33基因沉默的D2SC mDC的上清，用ELISA方法检测一型干扰素反应。其中，在reovirus组，DHX33基因沉默细胞以及阳性对照组IPS-1产生一型干扰素产量都有显著下降。而在LPS刺激后，DHX33基因沉默的D2SC几乎不产生TNF-α和IL6。由此证明了在D2SC中，DHX33还能识别RNA病毒感染。2. DHX33在BMDCs中识别dsRNA及RNA病毒的免疫功能研究接下来我们要进一步研究DHX33是否在原代细胞中识别dsRNA以及RNA病毒。我们制备了小鼠BMDCs。将scrambled shRNA基因沉默对照的BMDCs作为阴性对照，IPS-I基因沉默的BMDCs作为阳性对照。分别用长或短polyI:C刺激细胞，通过ELISA方法检测细胞上清产生一型干扰素水平（IFN-α和IFN-β）。DDX33基因沉默BMDCs对长或短polyI:C产生一型干扰素的量都较对照组明显下降。结果表明，在原代细胞中DHX33既能识别长polyI:C又能识别短polyI:C。接下来我们要研究DHX33在BMDCs中是否识别病毒感染。我们收集reovirus或LPS感染的阴性、阳性对照组细胞以及DHX33基因沉默的BMDCs的上清，用ELISA方法检测一型干扰素反应。其中，在reovirus组，DHX33基因沉默细胞以及阳性对照组IPS-1产生一型干扰素产量都有显著下降。而在LPS刺激后，DHX33基因沉默BMDCs几乎不产生TNF-α和IL6。由此证明了在BMDCs中，DHX33还能识别RNA病毒感染。3.重组DHX33“恢复”DHX33基因沉默的D2SC对dsRNA的免疫反应我们在DHX33基因沉默的D2SC中加入pCMV-HA载体及pCMV-HA-DHX33载体并通过IB实验观察DHX33表达情况。我们发现，Vector组中DHX33蛋白表达较对照组明显下降，而加入重组DHX33的D2SC“恢复”了DHX33蛋白表达。进一步，用ELISA方法检测长polyI:C及短polyI:C刺激2组细胞产生的细胞因子水平。结果显示，加入重组DHX33的D2SC与Vector组比较，一型干扰素水平得到了明显提升。4.研究DHX33依赖的信号通路在DHX33基因沉默及IPS-1基因沉默的MDA-5和RIG-I基因缺陷的MEFs中，我们用IB实验检测DHX33及IPS-1基因沉默细胞的蛋白表达效率。然后，应用QPCR再次确认目的基因沉默效率。最后用短polyI:C刺激上述MEFs，通过ELISA检测一型干扰素水平。我们看到与对照组相比，DHX33基因沉默后无论在MDA-5基因缺陷的MEFs还是在RIG-I基因缺陷的MEFs，产生IFN-α的量依旧明显下降。证明了DHX33介导的信号通路与MDA5及RIG-I无关。5.探讨DHX33与polyI:C结合的关系我们用HA-全长DHX33以及一系列HA-截短DHX33蛋白分别与生物素标记的polyI:C共孵育，用链霉亲和素beads下拉蛋白。通过IP实验证明了DHX33的HELICc结构域与polyI:C直接结合。为了了解DHX33与polyI:C是否特异性结合。我们设计了竞争性实验。在HA-DHX33与生物素标记的polyI:C的混合物中加入梯度增量的未标记的polyI:C或polyU，用中性蛋白亲和素beads下拉蛋白。我们发现只有未标记的polyI:C可以阻碍生物素标记的polyI:C与DHX33的结合，进一步证实了DHX33与polyI:C为特异性结合关系。6.探讨DHX33与IPS-1结合的关系将Myc-IPS-I与表达HA-全长DHX33或一系列HA-截短DHX33蛋白孵育后用抗Mycbeads下拉蛋白。反之，用HA-DHX33与表达Myc-全长IPS-1或一系列Myc-截短IPS-1孵育后用抗HAbeads下拉蛋白。分别通过IP实验证明了DHX33通过HELICc区与IPS-I的C末端结合。7. DHX33与IPS-1介导的下游信号通路机制研究由于IRF3和p65分别是IFNs和NF-kB的二聚体形式。同时Erk1/2和p38是参与MAPK信号通路的重要分子。因此，我们通过追踪上述分子磷酸化形式的存在来初步了解DHX33与IPS-1所介导的信号通路。将schramble shRNA基因沉默对照组细胞、IPS-1基因沉默以及DHX33基因沉默的D2SC mDC分别用长polyI:C进行刺激。提取全细胞裂解液并且用SDS-PAGE免疫印迹法分离蛋白。在D2SC的对照组中，磷酸化的p65，Erk1/2，p38以及IRF3在60分钟到120分钟之间时间点中均能检测到。而在表达IPS-1基因沉默以及DHX33基因沉默的D2SCmDC中，无论哪一个时间点都检测不到磷酸化的p65，Erk1/2，p38以及IRF3蛋白表达。由此证明了DHX33与IPS-1结合介导的信号通路需要IRF3、NF-kB以及MAPK的激活。通过上述实验，我们得到以下结论：1.在D2SC mDC及原代细胞中，DHX33既能识别dsRNA又能识别RNA病毒。2.重组的DHX33可以“恢复”DHX33基因沉默的D2SC对dsRNA的免疫反应。3. DHX33介导的信号通路不依赖于RIG-I或MDA5。4. DHX33通过HELICc结构域与polyI:C特异性结合。5. DHX33通过HELICc结构域与IPS-I的C末端结合。6.在mDC中，DHX33介导的信号通路需要MAP激酶，NF-kB以及IRF3的激活。成果的创造性以及在研究领域中的地位：在解旋酶家族中，发现一个能识别dsRNA和RNA病毒的新分子DHX33。通过进一步研究，DHX33与IPS-1介导的信号通路不依赖于RIG-I或MDA5，提示DHX33与IPS-1接头蛋白结合可能介导新的信号通路。DHX33具有成为治疗感染性疾病的靶向分子的潜质。