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研究背景目前,肺癌是死亡率居于首位的肿瘤疾病,肺腺癌是最主要的亚型,约占肺癌的40%。肺腺癌早期无症状或局部症状较少,发展进程相对较长,晚期通常易复发。过去十年,虽然针对EGFR和ALK的治疗取得相应的进展,但是由于化疗抵抗,复发和远处转移仍然是面临的挑战,晚期患者五年15%的存活率并没有明显改善。有学者提出,在恶性肿瘤组织中存在着一小部分具有干细胞样特性的细胞亚群,也就是被普遍称为的肿瘤干样细胞(cancer stem-like cells,CSLCs)或称肿瘤起始细胞(tumor initiating cells,TICs),不仅具有与干细胞相类似的自我更新和多项分化的能力,而且被认为可能是多种类型肿瘤的起源。研究表明,在肺癌及肺腺癌中也存在有肿瘤干细胞,被称为肺癌干细胞(lung cancer stem cells,LCSCs),其对化疗药物,放射治疗具有抵抗能力,因此提出肺癌干细胞是肺癌复发,转移的根本。换言之,肺癌也是一种干细胞疾病,因此,从肺腺癌干细胞这一角度作为切入点进一步研究将为治疗肺腺癌开拓新理念。肿瘤干细胞除了比普通肿瘤细胞在侵袭转移能力上更强,以及对放化疗抵抗能力之外,其本质的区别是具有干细胞特性,也即自我更新(self-renewal)。无论是肿瘤的起始进展还是复发和转移灶的形成均有赖于肿瘤干细胞的自我更新。因此,阐明肿瘤干细胞的自我更新机制有助于研制出改善肺癌生存率的有效药物。肿瘤干细胞的自我更新不仅受到内在信号的调控,比如Notch,Hedgehog,EGF,FGF,IGF等信号通路,同时也受到mi RNAs的调控,mi RNAs(microRNAs)是一类近年来新发现的长约19-22个核苷酸(nt)的非编码单链小分子RNA,主要在转录后水平调控靶基因(target)蛋白的表达。众多的证据表明,mi RNA参与肿瘤的调控作用不容忽视。类似于癌基因或抑癌基因在肿瘤细胞的一系列的生物学过程中发挥了重要的调控作用。mi RNA的序列虽小,但是仅一个mi RNA就可以调控多个靶基因,形成序列放大的基因调控通路;而一个miRNA也可以受多个基因的调控,从而在生物体内构成了一个庞大的复杂基因调控网络。目前研究发现,miRNA参与了干细胞以及肿瘤干细胞自我更新和多向分化潜能的调节,是mirna领域的研究热点,方兴未艾。例如mir-290、mir-296通过靶向自我更新相关转录因子oct-4、tcf3、sox2、nanog调控胚胎干细胞的自我更新和多向分化。let-7通过h-ras和hmga2调控乳腺癌干细胞的自我更新及恶性增殖等。那么,肺癌干细胞的自我更新是如何被调控的呢?是否有mirnas调控了肺癌干细胞的自我更新呢?它们是怎样参与肺癌干细胞自我更新的呢?对指导临床工作又有怎样的意义呢?这些问题成为本课题研究的主要内容。研究目的1.检测肺腺癌干细胞中mir-214的表达。2.明确mir-214在肺腺癌干细胞自我更新中的调控作用。3.探讨mir-214调控肺腺癌干细胞自我更新的具体机制。研究方法一、mir-214在肺腺癌干细胞中的表达1.通过过表达mir-214,采用real-timepcr方法,比较a549,nci-h1650肺癌细胞系来源的cslcs和非cslcs中干细胞标记物的表达。2.通过过表达mir-214,采用成球实验检测a549,nci-h1650肺癌细胞系“球状”生长能力,流式细胞技术验证cd133+/epcam+比例。3.采用real-timepcr检测a549,nci-h1650肺癌细胞系来源的cslcs和非cslcs中mir-214的表达;通过a549,nci-h1650来源的cslcs再分化实验,检测分化过程中mir-214的表达情况。二、mir-214在laccslcs自我更新中的作用1.通过构建sh-mir-214慢病毒,采用成球实验检测mir-214体外对a549,nci-h1650肺癌细胞系来源的cslcs和原代肺癌细胞来源的cslcs自我更新的作用。2.通过构建sh-mir-214慢病毒,采用real-timepcr,免疫荧光技术,western-blot检测干细胞标记物(nanog,oct-4,sox-2,epcam)的表达。3.通过构建sh-mir-214慢病毒,采用pcrarray检测mir-214对自我更新相关信号通路的影响。4.通过构建sh-mir-214慢病毒后裸鼠体内荷瘤实验研究mir-214对nci-h1650肺癌细胞系来源的cslcs体内成瘤能力的影响。三、mir-214调控laccslcs自我更新作用的机制1.通过生物信息学方法和自我更新相关基因筛选mir-214的靶基因,并通过双荧光素酶报告基因,real-timepcr,western-blot和免疫荧光等实验验证。2.通过双转染sh-mir-214&sh-ctnnbip1,采用成球实验,real-timepcr,,western-blot和免疫荧光染色技术验证mir-214通过靶基因ctnnbip1在laccslcs自我更新中的作用。3.通过免疫组织化学等方法研究ctnnbip1在iiia期肺腺癌患者中的临床意义。研究结果1.mir-214在laccslcs中高表达我们通过mir-214过表达慢病毒载体技术,检测了mir-214对a549,nci-h1650肺癌细胞成球能力的作用,验证了干细胞标记物的表达;比较了a549,nci-h1650肺癌细胞系及原代肺癌来源的laccslcs和非cslcs之间mir-214的表达差异,通过成球实验和real-timepcr结果显示:过表达mir-214后,肺癌细胞a549,nci-h1650表现出成“球状”生长,其干细胞比例及标志物表达明显高于对照组;通过real-timepcr结果显示:a549,nci-h1650及原代肺癌来源的cslcsmir-214表达高于非cslcs;再分化过程中mir-214表达呈下降趋势。提示mir-214在laccslcs自我更新中发挥重要作用,因此,我们选择对mir-214参与laccslcs自我更新进行深入研究。2.mir-214促进laccslcs自我更新为了进一步明确mir-214在laccslcs中的作用,我们通过构建sh-mir-214慢病毒转染建立稳定表达的laccslcs,通过衡量sh-mir-214转染组与对照组成球数量和成球大小,证明mir-214促进laccslcs的自我更新。通过real-timepcr证实了下调mir-214表达后,与对照组相比,a549,nci-h1650来源的cslcs干细胞标记物(nanog、oct-4、epcam)mrna表达水平明显降低。通过western-blot,免疫荧光技术进一步证明sh-mir-214转染组nanog、sox-2、oct-4的蛋白表达显著低于对照组。同时,pcrarray结果显示:下调mir-214表达的laccslcs自我更新相关信号通路受到显著的影响。以上结果表明,mir-214能够促进肺腺癌干细胞自我更新。此外,通过体内荷瘤实验证明mir-214在体内成瘤方面具有更强的致瘤作用。3.mir-214通过靶基因ctnnbip1调控laccslcs自我更新通过生物信息学预测mir-214的潜在靶基因,结合pcrarray结果发现下调mir-214后影响最为显著的自我更新相关通路为wnt,在此基础上筛选出ctnnbip1为潜在靶基因,通过双荧光素酶报告基因证实了ctnnbip1是mir-214的直接靶基因。real-timepcr结果同时表明肺癌组织中mir-214与ctnnbip1mrna的表达呈显著负相关。通过western-blot,免疫荧光进一步验证了下调mir-214表达后,ctnnbip1蛋白水平表达显著升高。提示mir-214能够调控ctnnbip1蛋白水平的表达。为了明确miR-214是否通过靶基因CTNNBIP1参与肺癌干细胞自我更新,我们通过双转染sh-mi R-214&sh-CTNNBIP1,检测CSLCs的成球数量和成球大小的改变,发现双转染的CSLCs成球数量和成球大小显著高于sh-mi R-214转染组。通过western-blot结果表明,相较于sh-mi R-214转染组,sh-miR-214&sh-CTNNBIP1双转染组CTNNBIP1蛋白水平表达显著降低,β-catenin,Cyclin D1,Oct-4,Sox-2表达水平显著升高。以上结果表明,mi R-214是通过CTNNBIP1参与LAC CSLCs的自我更新。为了验证在肺腺癌中CTNNBIP1的表达是否影响患者的生存预后,我们找到IIIa期肺腺癌患者病理标本,采用免疫组化的方法检测CTNNBIP1在肺腺癌中的表达,发现高分化肺癌组织中CTNNBIP1表达高于低分化肺癌组织,高分化肺癌组织中Ki67表达高于低分化肺癌组织;经统计学分析发现CTNNBIP1的表达与肺腺癌的分化程度呈正相关,且与Ki67的表达呈反相关;进一步通过Kaplan-Meier生存曲线发现,CTNNBIP1高表达组生存时间显著高于低表达组,提示CTNNBIP1与肺腺癌预后密切相关。研究结论在肺腺癌中,mi R-214在LAC CSLCs中高表达,并通过CTNNBIP1促进LAC CSLCs的自我更新和小鼠体内成瘤,临床上,CTNNBIP1的表达与生存期密切相关,是肺腺癌预后的重要指标。