用SSH方法鉴别鸡就巢行为相关基因

• 作 者: 沈栩
• 机 构: 华南农业大学
• 出 处: 华南农业大学
• 发表日期: 2008年期
• 关键词: 鸡 就巢行为 抑制性消减杂交 差异表达

我国地方品种鸡顽固的就巢性是影响其产蛋性能的重要原因之一，就巢性制约了地方家禽品种遗传资源的开发和利用，因此减少和消除就巢性成为重要的育种目标。本研究试图利用抑制消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)等分子生物学的方法，找出与家鸡就巢行为相关的基因，从而为鸡就巢性的研究提供新的候选基因。
本实验取用6只210天龄全同胞江西黄母鸡为实验材料，其中3只表现出明显的就巢行为，另3只没有表现出就巢行为。利用SSH技术建立了鸡垂体组织的消减cDNA文库。该文库共包括阳性克隆461个，长度为61 bp-413 bp，归并为49个重叠群。利用NCBI Blast在线软件与Genbank数据库进行同源序列比对，结合比对结果，从中选出3条EST CNN16、CNN35、CNN45进行电子延伸，并通过设计引物对其进行扩增测序验证，采用实时荧光定量PCR对其在垂体中的表达进行研究。研究表明，3条EST显示了在就巢和不就巢状态下的表达差异，CNN16在就巢状态下家鸡的垂体中表现为下调作用，CNN35、CNN45表现为上调作用。
本实验还通过cDNA末端快速扩增(Rapid Amplication of cDNA End，RACE)和染色体步移技术对CNN45进行进一步的研究，克隆了2180 bp的基因组DNA和1715 bp的cDNA序列，其中编码区为1017 bp，5-UTR为293 bp，3-UTR为445bp，预测其为单外显子基因。并通过对候选EST进行基因组定位，将CNN45的延伸序列定位在鸡基因组重叠群WGA5383的708-1914区域。预测该基因编码的蛋白具有转座酶类似的功能。利用实时荧光定量PCR对该基因在就巢和不就巢状态下鸡的垂体和下丘脑的表达差异进行研究，广西黄鸡和清远麻鸡两个鸡种中的表达一致。该基因在就巢状态下的垂体表现为上调，明显高于在不就巢状态下的表达量(P<0.05)；而在下丘脑的表达则恰恰相反，在就巢状态下的下丘脑中的表达要明显低于在不就巢状态下的表达量(P<0.05)。因此初步认为，该基因可能与鸡就巢行为相关，具体功能需要进一步证明。