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随着肿瘤机制研究的不断深入,表观遗传学(epigenetics)已日益受到重视。表观遗传学是指在基因组序列不变的情况下,可以决定基因表达与否并可稳定遗传下去的调控信息；而表观遗传组学(epigenomics)是指在基因组水平上对表观遗传学改变的研究。目前,表观遗传组学研究已成为肿瘤研究领域的新前沿。DNA甲基化是哺乳动物基因组最为常见、研究最为深入的一种表观遗传学事件,参与调节多种生命活动。每种类型的肿瘤都有其特定的DNA甲基化模式,不同肿瘤或同一肿瘤的不同发生阶段中基因组DNA上CpG岛甲基化状态的差异,构成了肿瘤特定DNA甲基化谱。舌鳞状细胞癌(Tougue Squamous Cell Carcinoma, TSCC)是口腔鳞状细胞最为常见的恶性肿瘤,其发生发展的分子机制还未阐明。过去十几年中,在口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma, OSCC)中相关基因的DNA异常甲基化研究方面取得了一些进展,但大部分研究只是针对几个或一群基因采取候选基因研究方法,迄今还没有基于全基因组层面上直接、全面、系统分析TSCC中DNA甲基化情况的报道。舌鳞癌DNA甲基化谱建立不仅有助于全面揭示舌癌发生发展的分子机制,更重要的是可为舌鳞癌的早期诊断、治疗及预后评价等提供非常有价值的依据。缺少高通量筛选技术可能是影响基因组水平研究DNA甲基化谱系的关键因素。DNA甲基化芯片的发展为推动表观遗传组学研究提供了新的契机。NibmbleGen公司制备的甲基化芯片是目前国际上覆盖人类基因组CpG岛最多、注释最全面的一种芯片,而且这种芯片具有较高灵敏度和特异性的特点。基于以上因素,本课题采用最新发展的甲基化DNA免疫沉淀(Methylated DNA Immunoprecipitation, MeDIP)结合NimbleGen HG18 CpG Promoter芯片高通量分析舌鳞癌组织DNA甲基化情况,并结合芯片提供的信息,进一步在舌鳞癌组织和癌旁正常对照组织中分析基因的表达情况,初步筛选出舌鳞癌相关的基因。[甲基化芯片检测舌鳞癌基因组DNA甲基化分布]本课题收集了9例患者舌鳞癌肿瘤组织及其癌旁正常对照组织标本,并将9例标本分别抽提获得DNA,组成肿瘤和正常两组样品。采用MeDIP方法富集两组样品基因组DNA中甲基DNA片段,在严格的质控检验后,分别与两张甲基化芯片进行杂交,对杂交信号进行扫描以及初步数据处理,并对两组间数据进行比较分析。结果显示,有1269个DNA甲基化位点只存在于肿瘤组织中,其中涉及到330个基因,这些基因分布在不同的染色体上。定位在1号染色体上的甲基化差异基因最多,有28个,占肿瘤组织内甲基化差异基因的8.48%；其次,19号染色体上有27个,占差异总数的8.18%；而定位在18号染色体上的差异基因最少,只有4个,所占比率为1.21%;330个舌鳞癌组织中甲基化基因的甲基化区域有218个(66.1%)位于基因的启动子区,并有70%为CpG岛。同样,在癌旁正常对照组织中,差异DNA甲基化的位点共有1385个,涉及基因有321个。基因分布于各染色体上,其定位和分布数量差别较大。其中,定位在19号染色体上的甲基化差异基因最多,高达40个,占癌旁组织中甲基化差异基因的12.46%；其次为X染色体和1号染色体,分别有32个和23个,占差异总数的9.97%、7.17%；而定位在14号染色体上的差异基因最少,只有2个,所占比率为0.62%。321个甲基化基因的甲基化区域有210个(65.4%)位于基因的启动子区,43.6%为CpG岛。筛选得到的差异甲基化基因具有一定家族聚集性,四个角蛋白家族基因和六个跨膜蛋白家族基因均在肿瘤组织中发生甲基化；而7个黑色素瘤抗原家族成员则在癌旁正常对照组织中发生甲基化。采用在线GO分析网站Gostat对芯片筛选出来的差异甲基化基因进行功能分类,发现差异基因参与了基因转录调控、生殖、发育、代谢、离子转运、细胞生长和增殖、细胞分化和凋亡、细胞通讯、信号转导、细胞粘附等广泛的生物学过程,同时还涉及多条与机体免疫及肿瘤发生有关的信号通路,如Cell Communication、Purine metabolism、Cell adhesion molecules (CAMs)、Natural killer cell mediated cytotoxicity、Neuroactive、ligand-receptor、interaction、Glycerophospholipid metabolism、leukocyte transendothelial migration、Fc epsilon RI signaling pathway等。由此可以推测,这些甲基化异常的基因可能与TSCC的发生发展密切相关。[芯片结果的初步验证及肿瘤相关基因的初步筛选]从海量的芯片杂交数据中挑选出肿瘤组织中发生异常甲基化的ITIH5基因和FBLN1基因以及癌旁正常对照组织中发生异常甲基化的RUNX3基因,采用MSPCR方法检测三个基因分别在肿瘤组织和癌旁正常对照组织中的甲基化改变情况。结果发现,在癌旁正常对照组织中检测到ITIH5、FBLN1两个基因分别存在25%和20%的DNA异常甲基化,但两个基因在肿瘤组织中均存在较高频率的DNA异常甲基化,分别为70%(14／20)、55%(11／20)。统计学分析证实,两个基因在肿瘤组织和对照组织中的甲基化程度存在显著差异(P=0.004<0.01,P=0.026<0.05)。另外,RUNX3基因的DNA异常甲基化在癌旁正常对照组织和肿瘤组织中发生的频率分别为55%和15%,两者之间同样存在显著差异(P=0.008<0.01).MSPCR初步验证结果与芯片结果相似,初步证明芯片结果的可靠性。为了进一步筛选舌鳞癌相关的肿瘤基因,我们通过分析芯片结果,选择出与肿瘤发生密切相关的并在舌鳞癌组织中未深入研究的6个基因(BCL2L14、CDCP1、DIRAS、FBLN1、ITIH5、RUNX3)进行初步分析。采用RT-PCR方法对6个基因在舌鳞癌组织中的表达情况进行初步筛选,结果提示,DIRAS、FBLN1、ITIH5在舌鳞癌组织中表达下调(P<0.05),下调频率分别是45%(9／20)、40%(8／20)、55%(11／20)；而BCL2L14、CDCP1、RUNX3则在舌鳞癌组织中表达显著上调(P<0.05),上调频率分别是60%(12／20),50%(10／20),75%(15／20)。提示6个功能不同基因可能与舌鳞癌的发生发展有关。进一步对FBLN1、ITIH5、RUNX3三个基因进行表达异常与甲基化关系分析,结果发现,FBLN1、ITIH5基因分别在87.5%(7／8)、90.9%(10／11)表达下调的舌鳞癌组织标本中存在DNA异常甲基化；同样,RUNX3基因则在66.7%(10／15)表达上调的肿瘤组织对应的癌旁对照组织中存在异常甲基化。说明DNA异常甲基化与三个基因在组织中的表达异常有关。综上所述,通过本研究初步构建了人舌鳞癌组织与癌旁正常对照组织基因组DNA甲基化谱,得到了大量的DNA甲基化分布信息,为进一步建立更为精确的舌鳞癌DNA甲基化谱奠定了基础,也为阐明舌鳞癌发病的分子机制提供了可能。另外,本课题初步筛选出6个与舌鳞癌发生发展密切相关的基因,可作为以后更深入研究的靶标,为舌鳞癌临床诊断、治疗或预后等分子标志物的筛选提供了实验依据。