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小麦是世界上种植面积最广和最重要的粮食作物之一,约有40%的人口依靠小麦提供营养。土壤盐渍化是一个日益严重且不可忽视的全球性问题,世界上约7%的陆地表面受到盐渍化的影响,对区域农业发展构成严重威胁。获取能耐受生物或非生物胁迫的可遗传的高产、优质小麦尤显重要。实验室前期通过以普通小麦济南177(Triticum aestivum L.,2n=6x=42,简称JN177)和长穗偃麦草(Thinopyrumponticum,2n=70)为亲本的不对称体细胞杂交技术,培育了一系列小麦渐渗系品种山融3号(Shanrong No.3,简称SR3)和山融4号(Shanrong No.4,简称SR4)等。已有研究显示这些品系都具有很强的盐碱耐受性。本研究通过第二代高通量测序技术,对经盐碱处理获得的SR4转录组进行分析,得到一个在盐碱胁迫下上调的小麦锌指蛋白基因TaC2H2ZF,该基因属于C2H2转录因子家族。利用农杆菌介导的拟南芥花序浸染法将TaC2H2ZF转化哥伦比亚生态型拟南芥(记为Col-0)中;获得了两个高效表达的拟南芥过表达系(分别记为OE1和OE2)。该基因具有如下特性:该TaC2H2ZF包含两个典型保守的锌指结构域和一个保守的EAR抑制结构域;在包括盐碱处理的非生物胁迫下出现不同的表达模式。洋葱表皮细胞瞬时表达亚细胞定位分析将TaC2H2ZF定位于细胞核中;经酵母单杂交系统验证该蛋白不具有体外转录激活活性,推测可能与EAR抑制结构域相关。1.TaC2H2ZF在拟南芥中的逆境胁迫应答在正常营养土壤中Col-0、OE1、OE2和拟南芥同源基因突变体(MU)的生长没有明显差异。而在200 mM NaCl和60 mM的溶液摩尔比为NaHC03:Na2C03=9:1的碱性盐溶液处理后的土壤中,Col-0、OE1、OE2及MU四个系的生长受抑制显著,但两个OE系长势明显好于Col-0和MU。在1/2MS培养基中的Col-0、OE和MU系生长没有明显不同,而在加入200 mM NaCl和2.0 mM NaHC03胁迫的1/2MS培养基中,两个拟南芥OE系地上部分生长明显茁壮,根系要长于Col-0和MU系植株,OE系表现出明显的抗盐碱性,该结果与土壤中的表型实验一致。在1.0 mM H202的氧化胁迫和200 mM甘露醇的渗透胁迫下,两个OE系的相对叶片面积显著高于Col-0和MU系,显示了它们对氧化胁迫与渗透胁迫的显著抗性。选取土壤实验中200 mM NaCl和碱性盐溶液处理的拟南芥叶片进行DAB和NBT染色,结果显示OE系受到ROS毒害的作用明显低于Col-0和MU,ROS清除酶活性也有显著提升。推测ROS信号通路可能在TaC2H2ZF介导的抗盐碱胁迫的机制中发挥重要作用。2.TaC2H2ZF在小麦逆境胁迫中的应答利用农杆菌介导的小麦生长点转化法,将TaC2H2ZF构建入实验室改造的适于在单子叶植物中表达的pGA3426-2T载体中,对普通小麦扬麦20进行基因转化。利用PCR进行T0代转基因苗的阳性检测。从1000棵左右转基因植株中得到58棵阳性植株,转化率约为5.8%。收获T0代种子132粒。通过温室加代并进行T1代植株的PCR阳性检测,得到12棵阳性植株,转化率为9%。对PCR检测为阳性的植株叶片进行qRT-PCR;同时对T1代阳性植株分别在两叶一心期进行盐(200 mM NaCl)胁迫处理和碱胁迫(80mM NaHC03:Na2CO3=9:1)处理。14 d后分别测定小麦叶片中脯氨酸、丙二醛、SOD、POD、CAT等理化指标。结果显示:经200 mM NaCl及碱性盐溶液处理,与对照相比,转TaC2H2ZF基因小麦中的pro、SOD、POD等氧化酶含量均有升高,且随着盐浓度升高转基因小麦的升高幅度更加明显。而转基因小麦与对照植株中MDA的含量均升高,随处理浓度的升高,转基因小麦叶片中MDA的含量低于对照。说明转TaC2H2ZF基因小麦在盐溶液处理和碱性盐溶液下的表达活性高于对照。