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目的:
1.探索蛋白质染料染色机理；
2.探索DNA染料染色、负染机理；
3.为蛋白质组学研究人员提供合适的染料染色法；
4.为聚丙烯酰胺凝胶上小分子DNA的检测提供合适的方法。
方法:
1.蛋白质染料染色法:采用阴阳离子对技术,选用阴离子染料溶剂蓝和阳离子染料尼罗蓝组成离子对,确定最佳固定时间、染色时间、洗脱时间,同时考察染色液中的其它成分如盐离子、甘油等的作用,建立蛋白质染料染色操作步骤。
2.DNA染料染色法:选用乙基紫染料,考察影响染色结果的各个因素,如染色液的组成、染色时间、脱色时间等,建立乙基紫DNA染料染色操作步骤。
3.DNA负染染色方法:选用曙红染料,考察影响染色结果的各个因素,如染色液的组成、固定时间、染色时间、水洗时间,重点考察盐离子对染色结果的影响,建立DNA负染染色操作步骤。
结果:
1.建立了蛋白质染料染色法,灵敏度达4-8 ng/band,略高于传统的考马斯亮蓝染色法,其操作步骤如下:
(1)固定:电泳后,凝胶放入50 ml固定液固定30 min,固定液为40％7,醇/10％乙酸溶液；
(2)染色:弃去固定液,把凝胶放入50 ml染色液中染色30 min,染色液的组成为0.002％溶剂蓝/0.002％尼罗蓝/24％乙醇/7％乙酸溶液；
(3)脱色:在50 ml脱色液中脱色5 min,脱色液为24％7,醇/7％乙酸溶液。
2.建立了DNA染料染色法,灵敏度达0.8-1.6 ng/band,是尼罗蓝染色法的八倍(6.4-12.8 ng/band),略低于溴化乙锭染色法(0.4-0.8 ng/band),其操作步骤如下:
(1)染色:电泳后,凝胶放入50 ml染色液中染色20 min,染色液为0.0008％的乙基紫去离子水溶液；
(2)脱色:在50 ml50％乙醇中脱色1 min；
(3)水洗:去离子水水洗1 min。
3.建立了DNA负染染色方法,灵敏度达0.05-0.1 ng/band,其操作步骤如下:
(1)固定:电泳后,凝胶放入50ml固定液固定20min。固定液的组成为50％甲醇/7％7,酸溶液；
(2)染色:在25 ml染色液中染色20 min。染色液的组成50 mM ZnCl2/0.4％曙红/50％甲醇/20％甘油；
(3)水洗1-3 min。
结论:
1.新建立的蛋白质染料染色法灵敏、便捷,较适合于蛋白质组学的研究；
2.新建立的DNA染料染色法有望代替溴化乙锭,较好的实现了对聚丙烯酰胺胶上的DNA进行检测；
3.新建立的DNA负染方法是目前灵敏度最高的DNA负染方法,其灵敏度可以和DNA普通银染相媲美。