论文部分内容阅读
DNA作为生物体遗传信息的载体，在细胞内一般是以右手双螺旋结构存在，这种DNA结构被称为B型DNA(B-DNA)。DNA双螺旋结构在1953年第一次被Watson和Crick通过解析X-射线衍射所证实。在DNA中，具有重复片段的DNA序列占基因总数的50％。在特定条件下，这些重复的DNA序列能够形成不同于B-DNA的结构，如左手螺旋的Z-DNA、A-motif、三链体和四链体等，这些独特的DNA结构被称为非B型DNA(Non-B DNA)。近年来研究表明Non-B DNA的形成会影响基因的新陈代谢等一些重要生理过程，比如诱导基因的不稳定性，从而会引起人类的疾病。因此，关于Non-B DNA研究的重要性日益凸显。 本论文围绕四种重要的且典型的non-B DNA结构，G-四链体、i-motif、Z-DNA和A-motif展开研究:利用时间分辨紫外可见吸收光谱、时间分辨荧光光谱并结合圆二色光谱等稳态实验方法，研究了non-B DNA与配体的相互作用，探测并清晰区分同时共存的结合模式，为抗癌药物设计提供重要的理论依据;通过时间分辨的紫外可见吸收光谱方法，利用A-motif DNA修饰的纳米金自组装聚集显著增强分子的三重态，揭示了表面等离子体共振增强激发三重态的机理。本论文的研究工作包括以下四部分: 一、G-四链体高级结构与卟啉衍生物相互作用的机理研究 在non-B DNA中，G-四链体是由富含G碱基的DNA或RNA序列折叠形成的核酸二级结构，广泛存在于人体端粒和基因的启动子区域。含有22个碱基的人体端粒序列AG3(T2AG3)3能够形成经典的G-四链体单体。由于人体端粒DNA包含几十个(TTAGGG)重复单元，人体端粒更有可能形成G-四链体的高级结构，比如二聚体结构、多聚体结构。相比于G-四链体单体，G-四链体的高级结构更具有生物相关性。因此，配体识别G-四链体高级结构具有更重要的生物学意义。 尽管配体与G-四链体单体之间的相互作用已经有大量报道，配体与G-四链体高级结构相互作用的报道还很有限。在本工作中，我们设计合成了一类具有大臂的卟啉分子，这种大臂卟啉分子具有大的位阻效应。用聚乙烯醇(PEG)模拟生物体细胞内拥挤环境，我们发现这种大臂的卟啉分子能够选择性结合G-四链体高级结构而不结合G-四链体单体。进一步研究发现，大臂卟啉分子主要结合在G-四链体高级结构形成的夹层空腔之间。在G-四链体高级结构中，两个G-四链体单体可以形成一个夹层空腔结构，为配体提供了一个新结合位点。而G-四链体单体没有这种夹层结构，不能为配体提供结合位点，因此大臂卟啉分子不结合G-四链体单体。我们通过改变G-四链体结构的控制实验确认了这种夹层空腔结构位点的重要性。配体选择性识别更生物相关的G-四链体高级结构，能够在未来生物体实验中，以G-四链体高级结构作为药物设计靶点，为抗癌药物设计提供思路。 二、i-motif与卟啉相互作用的机理研究 与G碱基互补配对的C碱基同样存在于端粒区域。富含C碱基的DNA链也能够折叠成四条链的螺旋结构，称为C-四链体（又称为i-motif结构）。与G-四链体相似，i-motif的形成同样可以作为癌症治疗的特定药物靶点。相比于许多小分子（配体分子）可以结合并且能够调控G四链体的稳定性，仅有少量配体分子比如TMPyP4、吖啶二聚物、IMC-48和单壁碳纳米管，能够结合i-motif结构。清楚阐述配体与i-motif的结合机理将有助于设计与i-motif结合的配体。 通过稳态光谱（紫外可见吸收光谱、荧光光谱和诱导的CD光谱）及时间分辨的瞬态吸收光谱，我们研究了卟啉(TMPyP4)与两种i-motif四链体((C3TA2)3C3T和(C4A4C4)2)之间的相互作用。首次发现了卟啉与i-motif的插入作用模式，卟啉大环通过π-π堆积作用插入到C∶C+碱基对之间。瞬态吸收光谱方法能够在一次测量中同时探测到共存的两种结合模式，并且能够给出定量的百分比，其中主要的插入模式占80％，次要的大沟结合模式占20％。通过离子强度实验发现离子强度对结合模式有重要的影响，离子强度逐渐增大会导致插入模式百分比减少，大沟结合模式百分比增加。进一步设计合成了具有大臂的卟啉分子(T4)，通过T4大臂的位阻效应实现了选择性的大沟结合。 三、锌卟啉与双链DNA的相互作用:从B-DNA到Z-DNA 1972年，Pohl和Jovin第一次通过CD光谱的方法检测到了左手螺旋的DNA结构，称为Z-DNA。左手螺旋的Z-DNA可以特异性地结合一些蛋白质，意味着Z-DNA结构在生物学过程中扮演着极其重要的角色，比如基因的复制过程。 通过特异性结合配体分子来探测和识别Z-DNA能够帮助理解这些特殊DNA结构参与的生理过程。最近的研究表明锌卟啉(ZnTMPyP4)是一种识别Z-DNA有效的探针。然而，ZnTMPyP4与Z-DNA的结合机理仍然不清楚。我们通过瞬态吸收光谱，结合稳态光谱（紫外可见吸收光谱、荧光光谱和诱导的CD光谱），研究了两种配体分子(TMPyP4和ZnTMPyP4)分别与这两类DNA(B-DNA和Z-DNA)的相互作用机理。对于ZnTMPyP4/Z-DNA形成的复合物，有两种共存的结合模式。一种是通过吡啶基团和磷酸骨架的静电相互作用，另外一种是通过锌卟啉(ZnTMPyP4)的中心Zn(Ⅱ)与鸟嘌呤的N7配位的大沟结合。实验发现ZnTMPyP4与Z-DNA的结合模式与B-DNA的结合模式非常不同。ZnTMPyP4与B-DNA的结合模式主要是插入的结合模式和部分插入的结合模式。为了进一步验证锌卟啉(ZnTMPyP4)的中心Zn(Ⅱ)在结合中的作用，平面的卟啉分子TMPyP4作为一个对照实验也做了详细研究。研究结果表明没有轴向配位的卟啉分子与B-DNA和Z-DNA的结合模式是相同的，只有一种插入的结合模式，并且TMPyP4与Z-DNA的插入作用引起了Z-DNA到B-DNA的结构转变。这些结果对设计配体识别和探测Z-DNA提供了机理性指导。 四、A-motif DNA修饰的纳米金自组装聚集显著增强分子的三重态 纳米金具有独特的光学、电学和化学性质，其能够与入射光发生强烈的相互作用，使纳米金表面电子集体震荡，产生局域表面等离子共振，表面等离子共振效应可能会影响附近分子的激发态过程。富含A碱基的DNA链形成A-motif结构，A-motif DNA能够选择性结合小分子，诱导形成反平行双链DNA结构。我们利用A-motif DNA将纳米金自组装，实现了聚集增强分子的激发三重态。 通过时间分辨的紫外可见吸收光谱，探测A-motif修饰纳米金自组装聚集增强甲氧檗因(Coralyne)三重态的形成。A-motif修饰纳米金的自组装形成有序的空间三维结构分布，我们观测到36倍的三重态增强效应。在这种聚集结构中目标分子被限制在纳米金聚集形成的热点区域。目标分子在这些热点区域受到等离子共振效应的影响更强烈，处于热点区域的目标分子一方面增加了分子的激发效率，另一方面加快了系间窜跃，结果导致三重态增强效应大幅提升。A-motif修饰纳米金聚集体系不仅能够形成稳定的聚集而且还能诱导纳米金的可逆聚集。这种A-motif修饰纳米金形成的聚集结构可以通过温度控制来实现其聚集和解聚集过程。研究结果表明DNA修饰的纳米金自组装聚集能够作为一种新的等离子共振纳米天线，有望开启表面等离子体增强三重态方面的工作。增强三重态在三重态-三重态湮灭太阳能电池、光动力学治疗和生物成像等领域的应用。